ISO 21872-1:2017
(Main)Microbiology of the food chain — Horizontal method for the determination of Vibrio spp. — Part 1: Detection of potentially enteropathogenic Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae and Vibrio vulnificus
Microbiology of the food chain — Horizontal method for the determination of Vibrio spp. — Part 1: Detection of potentially enteropathogenic Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae and Vibrio vulnificus
ISO 21872-1:2017 specifies a horizontal method for the detection of enteropathogenic Vibrio spp., which causes human illness in or via the intestinal tract. The species detectable by the methods specified include Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae and Vibrio vulnificus. ISO 21872-1:2017 is applicable to the following: - products intended for human consumption and the feeding of animals; - environmental samples in the area of food production and food handling.
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour la détermination des Vibrio spp. — Partie 1: Recherche des espèces de Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae et Vibrio vulnificus potentiellement entéropathogènes
ISO 21872-1:2017 spécifie une méthode horizontale pour la recherche des espèces entéropathogènes de Vibrio provoquant des maladies dans ou via le tractus intestinal chez l'homme. Les espèces détectables par les méthodes spécifiées incluent Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae et Vibrio vulnificus. ISO 21872-1:2017 s'applique: - aux produits destinés à la consommation humaine et à l'alimentation animale; - aux échantillons environnementaux dans le domaine de la production et de la manutention de denrées alimentaires.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 21872-1
First edition
2017-06
Microbiology of the food chain —
Horizontal method for the
determination of Vibrio spp. —
Part 1:
Detection of potentially
enteropathogenic Vibrio
parahaemolyticus, Vibrio cholerae and
Vibrio vulnificus
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale pour
la détermination des Vibrio spp. —
Partie 1: Recherche des espèces de Vibrio parahaemolyticus, Vibrio
cholerae et Vibrio vulnificus potentiellement entéropathogènes
Reference number
ISO 21872-1:2017(E)
©
ISO 2017
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ISO 21872-1:2017(E)
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ISO 21872-1:2017(E)
Contents Page
Foreword .v
Introduction .vi
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 2
4 Principle . 2
4.1 General . 2
4.2 Primary enrichment in a liquid selective medium . 2
4.3 Secondary enrichment in a liquid selective medium . 3
4.4 Isolation and identification . 3
4.5 Confirmation . 3
5 Culture media and reagents . 3
5.1 Enrichment medium: alkaline saline peptone water (ASPW). 4
5.2 Solid selective isolation media . 4
5.2.1 First medium: thiosulphate, citrate, bile and sucrose agar medium (TCBS) . 4
5.2.2 Second medium. 4
5.3 Saline nutrient agar (SNA) . 4
5.4 Reagent for detection of oxidase . 4
5.5 Biochemical tests . 4
5.5.1 L-lysine decarboxylase saline medium (LDC) . 4
5.5.2 Arginine dihydrolase saline medium (ADH) . 4
5.5.3 Reagent for detection of β-galactosidase . 5
5.5.4 Saline medium for detection of indole . 5
5.5.5 Saline peptone waters . 5
5.5.6 Sodium chloride solution . 5
5.6 PCR . 5
5.6.1 Tris acetate EDTA buffer (TAE) (or a buffer allowing similar performance
for the purpose) . 5
5.6.2 Mastermix . 5
5.6.3 Primers and probes . 5
5.6.4 Positive control material . 5
5.6.5 Negative extraction control . 6
6 Equipment and consumables . 6
7 Sampling . 6
8 Preparation of the test sample . 6
9 Procedure (See Figure A.1) . 7
9.1 Test portion and initial suspension . 7
9.2 Primary selective enrichment . 7
9.3 Secondary selective enrichment . 7
9.4 Isolation and identification . 8
9.5 Confirmation . 8
9.5.1 General. 8
9.5.2 Selection of colonies for confirmation and preparation of pure cultures . 9
9.5.3 Tests for presumptive identification . 9
9.5.4 Biochemical confirmation .10
9.5.5 PCR confirmation .12
9.5.6 DNA extraction .12
9.5.7 Conventional PCR .12
9.5.8 Real-time PCR .13
10 Expression of results .13
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ISO 21872-1:2017(E)
11 Performance characteristics of the method .13
11.1 Interlaboratory study .13
11.2 Sensitivity .14
11.3 Specificity .14
11.4 LOD .14
50
12 Test report .14
Annex A (normative) Diagram of procedure .15
Annex B (normative) Composition and preparation of the culture media and reagents .17
Annex C (informative) Conventional PCR for the detection of Vibrio parahaemolyticus,
thermostable direct haemolysin (tdh) and thermostable direct related haemolysin
(trh) genes, Vibrio cholerae and Vibrio vulnificus .23
Annex D (informative) Real-time PCR for the detection of Vibrio parahaemolyticus,
thermostable direct haemolysin gene (tdh) and Vibrio vulnificus .27
Annex E (informative) Results of an interlaboratory study .29
Bibliography .32
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ISO 21872-1:2017(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the meaning of ISO specific terms and expressions related to conformity assessment,
as well as information about ISO’s adherence to the World Trade Organization (WTO) principles in the
Technical Barriers to Trade (TBT) see the following URL: www . i so .org/ iso/ foreword .html.
This document was prepared by the European Committee for Standardization (CEN) Technical
Committee CEN/TC 275, Food analysis — Horizontal methods, in collaboration with ISO Technical
Committee TC 34, Food products, Subcommittee SC 9, Microbiology, in accordance with the agreement
on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
This first edition cancels and replaces ISO/TS 21872-1:2007, which has been technically revised. It also
incorporates ISO/TS 21872-1:2007/Cor.1:2008.
The main changes are as follows:
— introduction of optional molecular identification methods for major food borne Vibrio spp.
(V. parahaemolyticus, including potentially enteropathogenic strains, V. vulnificus and V. cholerae);
— performance characteristics of the method have been added in Annex E.
A list of all parts in the ISO 21872 series can be found on the ISO website.
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ISO 21872-1:2017(E)
Introduction
Because of the large variety of food and feed products, the horizontal method described in this
document may not be appropriate in every detail for certain products. In this case, different methods,
which are specific to these products may be used if absolutely necessary for justified technical reasons.
Nevertheless, every attempt will be made to apply this horizontal method as far as possible.
The main changes, listed in the foreword, introduced in this document compared to ISO/TS 21872-
1:2007 are considered as major (see ISO 17468).
When this document is next reviewed, account will be taken of all information then available regarding
the extent to which this horizontal method has been followed and the reasons for deviations from this
method in the case of particular products.
The harmonization of test methods cannot be immediate and, for certain groups of products,
International Standards and/or national standards may already exist that do not comply with this
horizontal method. It is hoped that when such standards are reviewed they will be changed to comply
with this document so that eventually the only remaining departures from this horizontal method will
be those necessary for well-established technical reasons.
vi © ISO 2017 – All rights reserved
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 21872-1:2017(E)
Microbiology of the food chain — Horizontal method for
the determination of Vibrio spp. —
Part 1:
Detection of potentially enteropathogenic Vibrio
parahaemolyticus, Vibrio cholerae and Vibrio vulnificus
WARNING — In order to safeguard the health of laboratory personnel, it is essential that
tests for detection of Vibrio spp., and particularly toxigenic Vibrio cholerae, be conducted
only in laboratories equipped for this purpose and under the supervision of an experienced
microbiologist, and that great care is exercised in the disposal of contaminated material.
1 Scope
This document specifies a horizontal method for the detection of enteropathogenic Vibrio spp., which
causes human illness in or via the intestinal tract. The species detectable by the methods specified
include Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae and Vibrio vulnificus.
It is applicable to the following:
— products intended for human consumption and the feeding of animals;
— environmental samples in the area of food production and food handling.
NOTE 1 This method may not be appropriate in every detail for certain products (see Introduction).
NOTE 2 The World Health Organization (WHO) has identified that V. parahaemolyticus, V. cholerae and V.
vulnificus are the major food-borne Vibrio spp. However, the method in this document can also be appropriate for
[1]
the identification of other Vibrio spp. causing illness in humans.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 6887-1:2017, Microbiology of the food chain — Preparation of test samples, initial suspension and
decimal dilutions for microbiological examination — Part 1: General rules for the preparation of the initial
suspension and decimal dilutions
ISO 6887-3, Microbiology of the food chain — Preparation of test samples, initial suspension and decimal
dilutions for microbiological examination — Part 3: Specific rules for the preparation of fish and fishery
products
ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for
microbiological examinations
ISO 11133, Microbiology of food, animal feed and water — Preparation, production, storage and
performance testing of culture media
ISO 22118, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for the
detection and quantification of food-borne pathogens — Performance characteristics
© ISO 2017 – All rights reserved 1
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ISO 21872-1:2017(E)
ISO 22119, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Real-time polymerase chain reaction (PCR) for
the detection of food-borne pathogens — General requirements and definitions
ISO 22174, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Polymerase chain reaction (PCR) for the
detection of food-borne pathogens — General requirements and definitions
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
— ISO Online browsing platform: available at http:// www .iso .org/ obp
3.1
potentially enteropathogenic Vibrio spp.
microorganism which forms typical colonies on solid selective media and which possesses the described
biochemical or molecular characteristics when the test is performed in accordance with this document
Note 1 to entry: This document describes specific procedures for V. parahaemolyticus, V. cholerae and V. vulnificus.
3.2
detection of potentially enteropathogenic Vibrio spp.
determination of the presence or absence of potentially enteropathogenic Vibrio spp. (3.1)
(V. parahaemolyticus, V. cholerae and V. vulnificus) in a determined quantity of product, when the test is
performed in accordance with this document
4 Principle
4.1 General
The detection of potentially enteropathogenic Vibrio spp. (V. parahaemolyticus, V. cholerae and
V. vulnificus) requires four successive phases, as shown in the procedure diagram in Annex A.
Recovery of certain Vibrio spp. from foodstuffs may be improved by the use of different incubation
temperatures depending upon the target species or state of the food matrix. For example, recovery of
V. parahaemolyticus and V. cholerae in fresh products is enhanced by enrichment at 41,5 °C whereas
[2]
for V. vulnificus, and for V. parahaemolyticus and V. cholerae in deep frozen (<−18 °C), dried or salted
products, recovery is enhanced by enrichment at 37 °C. If detection of V. parahaemolyticus, V. cholerae
and V. vulnificus is required, all specified incubation temperatures should be used. If detection of
V. parahaemolyticus, V. cholerae and V. vulnificus together is not required, the specific procedure(s) may
be selected according to the species being sought. Such a selection should be clearly specified in the
test report.
NOTE V. parahaemolyticus, V. cholerae and V. vulnificus may be present in small numbers and are often
accompanied by a much larger number of other microorganisms belonging to the Vibrionaceae family or to other
families.
4.2 Primary enrichment in a liquid selective medium
Inoculation of the test portion in the primary enrichment medium alkaline saline peptone water
(ASPW) (5.1) at ambient temperature, followed by incubation at 41,5 °C for 6 h and/or 37 °C for 6 h.
The incubation conditions are determined by the target species and food product state.
For detection of all target species in deep frozen, dried or salted products, primary enrichment should
be at 37 °C.
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ISO 21872-1:2017(E)
For detection of V. vulnificus in all products, primary enrichment should be at 37 °C.
For detection of V. parahaemolyticus and/or V. cholerae only, in fresh products, primary enrichment
should be at 41,5 °C.
4.3 Secondary enrichment in a liquid selective medium
Inoculation of the second enrichment medium (ASPW) with the cultures obtained in 4.2.
Incubation of inoculated enrichment medium at 41,5 °C for 18 h and/or 37 °C for 18 h.
For detection of V. vulnificus in all products, secondary enrichment should be at 37 °C.
For detection of V. parahaemolyticus and/or V. cholerae only, in all products, secondary enrichment
should be at 41,5 °C.
4.4 Isolation and identification
From the cultures obtained in 4.2 and in 4.3, inoculation of two solid selective media:
— thiosulfate citrate bile and sucrose agar (TCBS) medium (5.2.1);
— another appropriate solid selective medium (left to the choice of the laboratory), such as chromogenic
agar, complementary to the TCBS medium (5.2.2).
Incubation of the TCBS medium at 37 °C, then examination after 24 h. Incubation of the second selective
medium according to the manufacturer’s recommendations.
4.5 Confirmation
Presumptive colonies of V. parahaemolyticus, V. cholerae and V. vulnificus isolated in 4.4 are subcultured
and confirmed by means of appropriate biochemical and/or polymerase chain reaction (PCR) tests.
Biochemical and/or PCR confirmation of isolates may be used for species identification, however,
reliable detection of enteropathogenic V. parahaemolyticus as determined by presence of the direct
thermostable haemolysin (tdh) and/or direct related haemolysin (trh) genes can only be carried out
using PCR tests.
It has been demonstrated that by screening ASPW broths using conventional PCR, the absence of
[3]
amplification of Vp-toxR can indicate no detection of V. parahaemolyticus. To reduce the amount
of downstream testing and, if shown to be reliable by the user laboratory, screening of incubated
enrichment broths may be used. This approach is only recommended after secondary enrichment and
does not apply to molecular targets for other Vibrio spp.
NOTE 1 Validation data generated in the preparation of this document demonstrated that PCR based
identification can be achieved by conventional PCR for V. parahaemolyticus, V. vulnificus and V. cholerae or real-
time PCR for V. parahaemolyticus and V. vulnificus. The PCR methods used in the development of this document
are given in Annexes C and D.
NOTE 2 Validation data for screening of secondary enrichment broths for amplification of Vp-toxR were not
generated in the preparation of this document.
5 Culture media and reagents
For general laboratory practice, refer to ISO 7218.
For clarity of the text, details of the composition of culture media and reagents and their preparation
are described in Annex B.
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ISO 21872-1:2017(E)
For performance testing of culture media, refer to ISO 11133.
NOTE Primers, probes and PCR running conditions used in the development of this document are given in
Annexes C and D.
5.1 Enrichment medium: alkaline saline peptone water (ASPW)
As specified in B.1.
5.2 Solid selective isolation media
5.2.1 First medium: thiosulphate, citrate, bile and sucrose agar medium (TCBS)
As specified in B.2. See Table 1 for performance testing data.
Table 1 — Performance testing of thiosulphate, citrate, bile and sucrose agar medium (TCBS)
a e
Function Incubation Control strains WDCM Method of Criteria Characteristic
control reactions
b
Productivity 37 °C ± 1 °C for Vibrio parahaemolyticus 00185 Qualitative Good Green colonies
24 h ± 3 h growth (2) (sucrose negative)
b
37 °C ± 1 °C for Vibrio furnissii 00186 Qualitative Good Yellow colonies
24 h ± 3 h growth (2) (sucrose positive)
c d
Selectivity 37 °C ± 1 °C for Escherichia coli 00012, Qualitative Total
24 h ± 3 h 00013 or inhibition —
00090 (0)
a
World Data Centre for Microorganisms (WDCM) strain catalogue available at http:// refs .wdcm .org
b
Strain to be used as a minimum (see ISO 11133).
c
Some national restrictions and directions may require the use of a different E. coli serovar. Make reference to national
requirements relating to the choice of E. coli serovars.
d
Strain free of choice; one of the strains shall be used as a minimum (see ISO 11133).
e
Growth is categorized as 0: no growth, 1: weak growth (partial inhibition), and 2: good growth (see ISO 11133).
5.2.2 Second medium
The selection of the second medium is left to the choice of the test laboratory. Preparation of the medium
should be strictly according to the manufacturer’s instructions.
5.3 Saline nutrient agar (SNA)
As specified in B.3.
5.4 Reagent for detection of oxidase
As specified in B.4.
5.5 Biochemical tests
5.5.1 L-lysine decarboxylase saline medium (LDC)
As specified in B.5.
5.5.2 Arginine dihydrolase saline medium (ADH)
As specified in B.6.
4 © ISO 2017 – All rights reserved
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ISO 21872-1:2017(E)
5.5.3 Reagent for detection of β-galactosidase
As specified in B.7.
5.5.4 Saline medium for detection of indole
As specified in B.8.
5.5.5 Saline peptone waters
As specified in B.9.
5.5.6 Sodium chloride solution
As specified in B.10.
5.6 PCR
5.6.1 Tris acetate EDTA buffer (TAE) (or a buffer allowing similar performance for the
purpose)
As specified in B.11.
5.6.2 Mastermix
Reagents shall be added in quantities as specified by the manufacturer’s instructions. See Annexes C
and D for example details of master mixes used in the development of this document.
5.6.3 Primers and probes
Primer (and hydrolysis probe) sequences if required shall be published in a peer-reviewed journal and
be verified for use against a broad range of target Vibrio spp. and non-target strains. With advances
in whole genome sequencing of bacterial strains, more appropriate species-specific markers may be
identified in the future.
For V. parahaemolyticus the target region should be toxR.
For determination of pathogenic strains of V. parahaemolyticus genes encoding the thermostable direct
(TDH) and the thermostable direct related (TRH) haemolysins should be targeted.
For V. cholerae the target region for conventional PCR should be the 16S-23S rRNA intergenic spacer
region prVC.
For V. vulnificus the target region should be the V. vulnificus haemolysin region (vvha).
Target regions other than those specified above for the identification of V. parahae
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 21872-1
Première édition
2017-06
Microbiologie de la chaîne
alimentaire — Méthode horizontale
pour la détermination des Vibrio
spp. —
Partie 1:
Recherche des espèces de Vibrio
parahaemolyticus, Vibrio cholerae
et Vibrio vulnificus potentiellement
entéropathogènes
Microbiology of the food chain — Horizontal method for the
determination of Vibrio spp. —
Part 1: Detection of potentially enteropathogenic Vibrio
parahaemolyticus, Vibrio cholerae and Vibrio vulnificus
Numéro de référence
ISO 21872-1:2017(F)
©
ISO 2017
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ISO 21872-1:2017(F)
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© ISO 2017, Publié en Suisse
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l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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ISO 21872-1:2017(F)
Sommaire Page
Avant-propos .v
Introduction .vi
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 2
4 Principes . 2
4.1 Généralités . 2
4.2 Premier enrichissement en milieu sélectif liquide . 3
4.3 Second enrichissement en milieu sélectif liquide . 3
4.4 Isolement et identification . 3
4.5 Confirmation . 3
5 Milieux de culture et réactifs . 4
5.1 Milieu d’enrichissement: eau peptonée alcaline salée (EPAS) . . 4
5.2 Milieux d’isolement sélectifs solides . 4
5.2.1 Premier milieu: milieu gélosé au thiosulfate, citrate, bile et saccharose (TCBS) . 4
5.2.2 Second milieu. 5
5.3 Gélose nutritive salée (GNS) . 5
5.4 Réactif pour la recherche de l’oxydase . 5
5.5 Essais biochimiques . 5
5.5.1 Milieu salé pour la détection de la L-lysine décarboxylase (LDC) . 5
5.5.2 Milieu salé pour la détection de l’arginine dihydrolase (ADH) . 5
5.5.3 Réactif pour la recherche de β-galactosidase . . 5
5.5.4 Milieu salé pour la recherche de l’indole . 5
5.5.5 Eaux peptonées salées . 5
5.5.6 Solution de chlorure de sodium . 5
5.6 PCR . 5
5.6.1 Tampon Tris Acétate EDTA (TAE) (ou un tampon permettant d’obtenir
des performances similaires) . 5
5.6.2 Mélange réactionnel . . 5
5.6.3 Amorces et sondes. 5
5.6.4 Témoin positif . 6
5.6.5 Témoin d’extraction négatif . 6
6 Matériel et consommables . 6
7 Échantillonnage . 7
8 Préparation de l’échantillon pour essai . 7
9 Mode opératoire (voir Figure A.1) . 7
9.1 Prise d’essai et suspension mère. 7
9.2 Premier enrichissement sélectif . 8
9.3 Second enrichissement sélectif. 8
9.4 Isolement et identification . 8
9.5 Confirmation . 9
9.5.1 Généralités . 9
9.5.2 Choix des colonies pour la confirmation et la préparation de cultures pures . 9
9.5.3 Essais d’identification présomptive .10
9.5.4 Confirmation biochimique .10
9.5.5 Confirmation par PCR . .12
9.5.6 Extraction d’ADN .13
9.5.7 PCR classique .13
9.5.8 PCR en temps réel .14
10 Expression des résultats.14
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ISO 21872-1:2017(F)
11 Caractéristiques de performance de la méthode .14
11.1 Étude interlaboratoires .14
11.2 Sensibilité .15
11.3 Spécificité .15
11.4 LD .15
50
12 Rapport d’essai .15
Annexe A (normative) Schéma du mode opératoire .16
Annexe B (normative) Composition et préparation des milieux de culture et des réactifs .18
Annexe C (informative) PCR classique pour la recherche de Vibrio parahaemolyticus,
des gènes de l’hémolysine thermostable directe, TDH (tdh), et de l’hémolysine
apparentée à la TDH (trh), de Vibrio cholerae et de Vibrio vulnificus .24
Annexe D (informative) PCR en temps réel pour la recherche de Vibrio parahaemolyticus,
du gène de l’hémolysine thermostable directe, TDH (tdh), et de Vibrio vulnificus .29
Annexe E (informative) Résultats d’une étude interlaboratoires .32
Bibliographie .36
iv © ISO 2017 – Tous droits réservés
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ISO 21872-1:2017(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: w w w . i s o .org/ iso/ fr/ avant -propos .html.
Le présent document a été élaboré par le comité technique CEN/TC 275, Analyse des produits
alimentaires — Méthodes horizontales, du Comité européen de normalisation (CEN) en collaboration avec
le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9, Microbiologie, conformément à
l’accord de coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
Cette première édition annule et remplace l’ISO/TS 21872-1:2007, qui ont fait l’objet d’une révision
technique. Elle intègre également l’ISO/TS 21872-1:2007/Cor.1:2008.
Les principales modifications sont les suivantes:
— introduction de méthodes d’identification moléculaire facultatives pour les principales espèces
de Vibrio d’origine alimentaire (V. parahaemolyticus, y compris les souches potentiellement
entéropathogènes, V. vulnificus et V. cholerae);
— ajout des caractéristiques de performance de la méthode dans l’Annexe E.
Une liste de toutes les parties de la norme ISO 21872 se trouve sur le site web de l’ISO.
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ISO 21872-1:2017(F)
Introduction
En raison de la grande diversité des produits alimentaires et des produits destinés à l’alimentation
animale, la méthode horizontale décrite dans le présent document peut ne pas convenir exactement,
dans tous ses détails, à certains d’entre eux. Dans ce cas, des méthodes différentes, spécifiques à ces
produits, peuvent être utilisées si cela s’avère absolument nécessaire pour des raisons techniques
justifiées. Néanmoins, tous les efforts seront déployés pour appliquer cette méthode horizontale chaque
fois que cela est possible.
Les principales modifications, listées dans l’avant-propos, qui ont été introduites dans le présent
document par comparaison à l’ISO/TS 21872-1:2007 sont considérées comme majeures (voir
l’ISO 17468).
À la prochaine révision du présent document, il sera tenu compte de toutes les informations collectées
depuis sa publication, indiquant dans quelle mesure la présente méthode horizontale aura été suivie et
les raisons pour lesquelles on y aura dérogé dans le cas de produits particuliers.
L’harmonisation des méthodes d’essai ne peut être réalisée de façon immédiate et, de ce fait, il peut
déjà exister, pour certains groupes de produits, des normes internationales et/ou nationales qui ne
concordent pas avec cette méthode horizontale. Lorsque de telles normes feront l’objet d’une révision, il
serait souhaitable qu’elles soient conformes au présent document de sorte que les seuls écarts restants
de cette méthode horizontale soient ceux qui sont nécessaires pour des raisons techniques bien établies.
vi © ISO 2017 – Tous droits réservés
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NORME INTERNATIONALE ISO 21872-1:2017(F)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode
horizontale pour la détermination des Vibrio spp. —
Partie 1:
Recherche des espèces de Vibrio parahaemolyticus,
Vibrio cholerae et Vibrio vulnificus potentiellement
entéropathogènes
AVERTISSEMENT — Afin de préserver la santé du personnel de laboratoire, il est essentiel que
les essais pour la recherche des espèces de Vibrio, et en particulier des V. cholerae toxinogènes,
ne soient réalisés que dans des laboratoires équipés à cet effet et sous la surveillance d’un
microbiologiste expérimenté, et qu’un grand soin soit pris lors de l’élimination des éléments
contaminés.
1 Domaine d’application
Le présent document spécifie une méthode horizontale pour la recherche des espèces entéropathogènes
de Vibrio provoquant des maladies dans ou via le tractus intestinal chez l’homme. Les espèces
détectables par les méthodes spécifiées incluent Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae et Vibrio
vulnificus.
Le présent document s’applique:
— aux produits destinés à la consommation humaine et à l’alimentation animale;
— aux échantillons environnementaux dans le domaine de la production et de la manutention de
denrées alimentaires.
NOTE 1 Cette méthode peut ne pas être appropriée dans les moindres détails pour certains produits (voir
l’Introduction).
NOTE 2 L’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) a identifié V. parahaemolyticus, V. cholerae et V. vulnificus
comme les principales espèces de Vibrio d’origine alimentaire. Cependant, le présent document peut également
[1]
convenir pour l’identification des autres espèces de Vibrio provoquant des maladies chez l’homme.
2 Références normatives
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des
exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 6887-1:2017, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Préparation des échantillons, de la suspension
mère et des dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique — Partie 1: Règles générales pour la
préparation de la suspension mère et des dilutions décimales
ISO 6887-3, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Préparation des échantillons, de la suspension
mère et des dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique — Partie 3: Règles spécifiques pour la
préparation des produits de la pêche
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations
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ISO 21872-1:2017(F)
ISO 11133, Microbiologie des aliments, des aliments pour animaux et de l’eau — Préparation, production,
stockage et essais de performance des milieux de culture
ISO 22118, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la détection et
la quantification des micro-organismes pathogènes dans les aliments — Caractéristiques de performance
ISO 22119, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) en temps réel pour la
détection des micro-organismes pathogènes dans les aliments — Exigences générales et définitions
ISO 22174, Microbiologie des aliments — Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour la recherche de
micro-organismes pathogènes dans les aliments — Exigences générales et définitions
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse http:// www .iso .org/ obp
3.1
espèces de Vibrio potentiellement entéropathogènes
micro-organismes formant des colonies caractéristiques sur des milieux sélectifs solides et possédant
les caractéristiques biochimiques ou moléculaires décrites, lorsque l’essai est réalisé conformément au
présent document
Note 1 à l’article: Le présent document décrit des modes opératoires spécifiques pour V. parahaemolyticus,
V. cholerae et V. vulnificus.
3.2
recherche des espèces de Vibrio potentiellement entéropathogènes
détermination de la présence ou de l’absence d’espèces de Vibrio potentiellement entéropathogènes (3.1)
(V. parahaemolyticus, V. cholerae et V. vulnificus) dans une quantité spécifiée de produit, lorsque l’essai
est réalisé conformément au présent document
4 Principes
4.1 Généralités
La recherche d’espèces de Vibrio potentiellement entéropathogènes (V. parahaemolyticus, V. cholerae
et V. vulnificus) exige quatre phases successives, comme indiqué dans le schéma du mode opératoire
figurant dans l’Annexe A.
La récupération de certaines espèces de Vibrio dans les aliments peut être améliorée en utilisant
différentes températures d’incubation en fonction de l’espèce ciblée ou de l’état de la matrice
alimentaire. Par exemple, la récupération de V. parahaemolyticus et V. cholerae dans les produits frais
est améliorée par enrichissement à 41,5 °C, alors que pour V. vulnificus, et pour V. parahaemolyticus et
[2]
V. cholerae dans les produits congelés (< −18 °C) , séchés ou salés, la récupération est améliorée par
enrichissement à 37 °C. Si la recherche de V. parahaemolyticus, V. cholerae et V. vulnificus est exigée,
il convient d’utiliser toutes les températures d’incubation spécifiées. Si la recherche simultanée de
V. parahaemolyticus, V. cholerae et V. vulnificus n’est pas exigée, le ou les modes opératoires spécifiques
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ISO 21872-1:2017(F)
peuvent être sélectionnés en fonction des espèces à rechercher. Il convient de spécifier clairement cette
sélection dans le rapport d’essai.
NOTE V. parahaemolyticus, V. cholerae et V. vulnificus peuvent être présents en petit nombre et sont souvent
accompagnés d’un nombre beaucoup plus grand d’autres micro-organismes appartenant à la famille des
Vibrionaceae ou à d’autres familles.
4.2 Premier enrichissement en milieu sélectif liquide
Ensemencement de la prise d’essai dans le premier milieu d’enrichissement à base d’eau peptonée
alcaline salée (EPAS) (5.1) à température ambiante, puis incubation à 41,5 °C pendant 6 h et/ou à 37 °C
pendant 6 h.
Les conditions d’incubation sont déterminées par les espèces ciblées et l’état du produit alimentaire.
Pour la recherche de toutes les espèces ciblées dans les produits congelés, séchés ou salés, il convient
d’effectuer le premier enrichissement à 37 °C.
Pour la recherche de V. vulnificus dans tous les produits, il convient de procéder au premier
enrichissement à 37 °C.
Pour la recherche de V. parahaemolyticus et/ou V. cholerae uniquement, dans les produits frais, il
convient de procéder au premier enrichissement à 41,5 °C.
4.3 Second enrichissement en milieu sélectif liquide
Ensemencement du second milieu d’enrichissement (EPAS) avec les cultures obtenues en 4.2.
Incubation du milieu d’enrichissement ensemencé à 41,5 °C pendant 18 h et/ou à 37 °C pendant 18 h.
Pour la recherche de V. vulnificus dans tous les produits, il convient de procéder au second enrichissement
à 37 °C.
Pour la recherche de V. parahaemolyticus et/ou V. cholerae uniquement, dans tous les produits, il
convient de procéder au second enrichissement à 41,5 °C.
4.4 Isolement et identification
À partir des cultures obtenues en 4.2 et en 4.3, ensemencement de deux milieux sélectifs solides:
— milieu gélosé au thiosulfate, citrate, bile et saccharose (TCBS) (5.2.1);
— un autre milieu sélectif solide approprié (dont le choix est laissé au laboratoire), tel que la gélose
chromogène, en complément du milieu TCBS (5.2.2).
Incubation du milieu TCBS à 37 °C, puis examen après 24 h. Incubation du second milieu sélectif selon
les recommandations du fabricant.
4.5 Confirmation
Les colonies présumées V. parahaemolyticus, V. cholerae et V. vulnificus isolées en 4.4 sont repiquées et
confirmées au moyen d’essais biochimiques appropriés et/ou d’essais de réaction de polymérisation en
chaîne (PCR).
La confirmation biochimique et/ou par PCR d’isolats peut être utilisée pour l’identification d’espèces;
toutefois, la recherche fiable de V. parahaemolyticus entéropathogènes, tels que déterminés par la
présence de gènes de l’hémolysine thermostable directe, TDH (tdh), et/ou de l’hémolysine apparentée à
la TDH (trh), ne peut être effectuée que par des essais de PCR.
Il a été démontré qu’en procédant à un criblage de bouillons d’EPAS par PCR classique, l’absence
[3]
d’amplification de Vp-toxR peut indiquer l’absence de détection de V. parahaemolyticus. Afin de réduire
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ISO 21872-1:2017(F)
le nombre d’essais en aval et si sa fiabilité a été démontrée par le laboratoire utilisateur, le criblage
de bouillons d’enrichissement incubés peut être utilisé. Cette approche est uniquement recommandée
après le second enrichissement et ne s’applique pas aux autres cibles moléculaires des espèces de Vibrio.
NOTE 1 Des données de validation générées lors de la préparation du présent document ont démontré que
l’identification par PCR peut être effectuée par une PCR classique pour V. parahaemolyticus, V. vulnificus et
V. cholerae, ou par une PCR en temps réel pour V. parahaemolyticus et V. vulnificus. Les méthodes PCR utilisées
pour l’élaboration du présent document sont décrites dans les Annexes C et D.
NOTE 2 Les données de validation pour le criblage de bouillons du second enrichissement en vue de
l’amplification de Vp-toxR n’ont pas été générées lors de la préparation du présent document.
5 Milieux de culture et réactifs
Pour les pratiques générales de laboratoire, se reporter à l’ISO 7218.
Pour la clarté du texte, les détails de la composition et de la préparation des milieux de culture et des
réactifs sont décrits dans l’Annexe B.
Pour les essais de performance des milieux de culture, se reporter à l’ISO 11133.
NOTE Les amorces, les sondes et les conditions de la PCR utilisées pour l’élaboration du présent document
sont décrites dans les Annexes C et D.
5.1 Milieu d’enrichissement: eau peptonée alcaline salée (EPAS)
Tel que spécifié en B.1.
5.2 Milieux d’isolement sélectifs solides
5.2.1 Premier milieu: milieu gélosé au thiosulfate, citrate, bile et saccharose (TCBS)
Tel que spécifié en B.2. Voir le Tableau 1 pour les données d’essai de performance.
Tableau 1 — Essais de performance du milieu gélosé au thiosulfate, citrate, bile et
saccharose (TCBS)
Méthode de Réactions
a e
Fonction Incubation Souches de contrôle WDCM Critères
contrôle caractéristiques
b
Productivité 37 °C ± 1 °C Vibrio parahaemoly- 00185 Qualitative Bonne Colonies vertes
pendant ticus croissance (saccharose négatif)
24 h ± 3 h (2)
b
37 °C ± 1 °C Vibrio furnissii 00186 Qualitative Bonne Colonies jaunes
pendant croissance (saccharose positif)
24 h ± 3 h (2)
c d
Sélectivité 37 °C ± 1 °C Escherichia coli 00012, Qualitative Inhibition
pendant 00013 ou totale (0) —
24 h ± 3 h 00090
a
Catalogue de souches du World Data Centre for Microorganisms (WDCM) disponible à l’adresse: http:// refs .wdcm .org.
b
Souches à utiliser au minimum (voir ISO 11133).
c
Certaines restrictions nationales et directives peuvent nécessiter l’utilisation d’un sérovar d’E. coli différent. Se référer
aux exigences nationales relatives au choix des sérovars d’E. coli.
d
Souches au choix; au moins l’une des souches doit être utilisée (voir ISO 11133).
e
La croissance est classée en: 0 : croissance nulle, 1 : croissance faible (inhibition partielle), et 2 : croissance marquée
(voir ISO 11133).
4 © ISO 2017 – Tous droits réservés
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Questions, Comments and Discussion
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