ISO 16649-3:2015

DRAFT INTERNATIONAL STANDARD ISO/DIS 16649-3
ISO/TC 34/SC 9 Secretariat: AFNOR
Voting begins on Voting terminates on

2013-04-18 2013-09-18
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION  •  МЕЖДУНАРОДНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ  •  ORGANISATION INTERNATIONALE DE NORMALISATION


Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal
method for the enumeration of beta-glucuronidase-positive
Escherichia coli —
Part 3:
Detection and most probable number technique using
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronide
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour le dénombrement des Escherichia coli bêta-
glucuronidase positive —
Partie 3: Technique du nombre le plus probable utilisant le bromo-5-chloro-4-indolyl-3 beta-D-glucuronate
ICS 07.100.30





ISO/CEN PARALLEL PROCESSING
This draft has been developed within the International Organization for Standardization (ISO), and
processed under the ISO-lead mode of collaboration as defined in the Vienna Agreement.
This draft is hereby submitted to the ISO member bodies and to the CEN member bodies for a parallel
five-month enquiry.
Should this draft be accepted, a final draft, established on the basis of comments received, will be
submitted to a parallel two-month approval vote in ISO and formal vote in CEN.

To expedite distribution, this document is circulated as received from the committee
secretariat. ISO Central Secretariat work of editing and text composition will be undertaken at
publication stage.
Pour accélérer la distribution, le présent document est distribué tel qu'il est parvenu du
secrétariat du comité. Le travail de rédaction et de composition de texte sera effectué au
Secrétariat central de l'ISO au stade de publication.



THIS DOCUMENT IS A DRAFT CIRCULATED FOR COMMENT AND APPROVAL. IT IS THEREFORE SUBJECT TO CHANGE AND MAY NOT BE
REFERRED TO AS AN INTERNATIONAL STANDARD UNTIL PUBLISHED AS SUCH.
IN ADDITION TO THEIR EVALUATION AS BEING ACCEPTABLE FOR INDUSTRIAL, TECHNOLOGICAL, COMMERCIAL AND USER PURPOSES, DRAFT
INTERNATIONAL STANDARDS MAY ON OCCASION HAVE TO BE CONSIDERED IN THE LIGHT OF THEIR POTENTIAL TO BECOME STANDARDS TO
WHICH REFERENCE MAY BE MADE IN NATIONAL REGULATIONS.
RECIPIENTS OF THIS DRAFT ARE INVITED TO SUBMIT, WITH THEIR COMMENTS, NOTIFICATION OF ANY RELEVANT PATENT RIGHTS OF WHICH
THEY ARE AWARE AND TO PROVIDE SUPPORTING DOCUMENTATION.
©  International Organization for Standardization, 2013

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ISO/DIS 16649-3

COPYRIGHT PROTECTED DOCUMENT


©  ISO 2013
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means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting on the internet or an intranet, without prior written permission.
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ISO/DIS 16649-3
Contents Page
Foreword . iv
Introduction . vi
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 2
4 Principle. 2
4.1 Detection method . 2
4.2 Enumeration method . 3
5 Dilution fluids and culture media . 3
5.1 Dilution fluids . 3
5.2 Culture media . 4
5.2.1 Minerals modified glutamate medium (selective enrichment medium) . 4
5.2.2 Tryptone bile glucuronide agar (second selective medium) . 5
5.2.3 Performance testing for the quality assurance of the culture media . 5
6 Apparatus and glassware . 6
7 Sampling. 6
8 Preparation of test sample . 7
9 Procedure . 7
9.1 Detection method . 7
9.1.1 Test portion, initial suspension and dilutions . 7
9.1.2 Incubation. 7
9.1.3 Subculturing . 7
9.1.4 Second incubation . 7
9.1.5 Examination of the plates . 7
9.1.6 Interpretation . 7
9.2 Enumeration method . 7
9.2.1 Test portion, initial suspension and dilutions . 7
9.2.2 Inoculation of the selective enrichment . 8
9.2.3 Incubation. 8
9.2.4 Subculturing . 8
9.2.5 Second incubation . 8
9.2.6 Examination of the plates . 8
9.2.7 Interpretation . 8
10 Expression of results . 8
10.1 Detection method . 8
10.2 Enumeration method . 9
11 Precision. 9
12 Test report . 9
Bibliography . 10


© ISO 2013 – All rights reserved iii

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ISO/DIS 16649-3
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 16649-3 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9,
Microbiology.
This second/third/. edition cancels and replaces the first/second/. edition (), [clause(s) / subclause(s) /
table(s) / figure(s) / annex(es)] of which [has / have] been technically revised.
ISO 16649 consists of the following parts, under the general title Microbiology of food and animal feed —
Enumeration of β-glucuronidase positive Escherichia coli:
 Part 3: Detection and most probable number technique using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide
 Part [n]:
 Part [n+1]:

ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 16649-3 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9,
Microbiology.
iv © ISO 2013 – All rights reserved

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ISO/DIS 16649-3
This second/third/. edition cancels and replaces the first/second/. edition (), [clause(s) / subclause(s) /
table(s) / figure(s) / annex(es)] of which [has / have] been technically revised.
ISO 16649 consists of the following parts, under the general title Microbiology of food and animal feed —
Enumeration of β-glucuronidase positive Escherichia coli:
 Part 1: Colony count technique at 44 °C using membranes and 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-
glucuronide
 Part 2: Colony count technique at 44 °C using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- β- D-glucuronide
 Part 3: Detection and most probable number technique using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide

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ISO/DIS 16649-3
Introduction
Because of the large variety of food and feed products, this horizontal method may not be appropriate in every
detail for certain products. In this case, different methods, which are specific to these products may be used if
absolutely necessary for justified technical reasons. Nevertheless, every attempt will be made to apply this
horizontal method as far as possible.
When this International Standard is next reviewed, account will be taken of all information then available
regarding the extent to which this horizontal method has been followed and the reasons for deviations from
this method in the case of particular products.
The harmonization of test methods cannot be immediate, and for certain groups of products International
Standards and/or national standards may already exist that do not comply with this horizontal method. It is
hoped that when such standards are reviewed they will be changed to comply with this International Standard
so that eventually the only remaining departures from will be those necessary for well-established technical
reasons.

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DRAFT INTERNATIONAL STANDARD ISO/DIS 16649-3

Microbiology of food and animal feed — Enumeration of
β-glucuronidase positive Escherichia coli — Part 3: Detection
and most probable number technique using 5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-β-D-glucuronide
1 Scope
This International Standard specifies a horizontal method for the detection and enumeration of
-glucuronidase positive Escherichia coli, by means of the liquid-medium culture technique and calculation of
the most probable number (MPN) after incubation at 37 °C, then at 44 °C. This International Standard is
applicable to:
 products intended for human consumption and the feeding of animals; and
 environmental samples in the area of food production and food handling
The method is suitable for the enumeration of cells of Escherichia coli that may have been subjected to stress
arising from dehydration, freezing, exposure to a saline (such as marine) environment or damage by
disinfectants such as chlorine-containing products.
A limitation of the applicability of this International Standard is imposed by the susceptibility of the method to a
large degree of variability. The method should be applied and the results interpreted in the light of the
information given in 11.
This method has not been fully evaluated for all matrices, e.g. for milk and milk products. ISO 7251 should be
used for milk and milk products.
WARNING — Strains of Escherichia coli that do not grow at 44 °C and, in particular, those that are
-glucuronidase negative, such as Escherichia coli O157 and some other strains of pathogenic E. coli,
will not be detected by the method described in this International Standard.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated references,
the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 6887-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Preparation of test samples, initial suspension
and decimal dilutions for microbiological examination — Part 1: General rules for the preparation of the initial
suspension and decimal dilutions
ISO 6887-2, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Preparation of test samples, initial suspension
and decimal dilutions for microbiological examination — Part 2: Specific rules for the preparation of meat and
meat products
ISO 6887-3, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Preparation of test samples, initial suspension
and decimal dilutions for microbiological examination — Part 3: Specific rules for the preparation of fish and
fishery products
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1

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ISO/DIS 16649-3
ISO 6887-4, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Preparation of test samples, initial suspension
and decimal dilutions for microbiological examination — Part 4: Specific rules for the preparation of products
other than meat, dairy and seafood products
ISO 6887-5, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Preparation of test samples, initial suspension
and decimal dilutions for microbiological examination — Part 5: Specific rules for the preparation of milk and
milk products
ISO 7251, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the detection and
enumeration of presumptive Escherichia coli — Most probable number technique
ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General rules for microbiological examinations
ISO TS 11133-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Guidelines on preparation and production
of culture media — Part 1: General guidelines on quality assurance of culture media in the laboratory
ISO TS 11133-2, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Guidelines on preparation and production
of culture media — Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following te
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 16649-3
Première édition
2015-05-15
Version corrigée
2016-12-15
Microbiologie de la chaîne
alimentaire — Méthode horizontale
pour le dénombrement des
Escherichia coli bêta-glucuronidase
positive —
Partie 3:
Recherche et technique du nombre le
plus probable utilisant le bromo-5-
chloro-4-indolyl-3 ß-D-glucuronate
Microbiology of the food chain — Horizontal method for the
enumeration of beta-glucuronidase-positive Escherichia coli —
Part 3: Detection and most probable number technique using
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-glucuronide
Numéro de référence
ISO 16649-3:2015(F)
©
ISO 2015

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ISO 16649-3:2015(F)

DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
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sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
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ISO 16649-3:2015(F)

Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .vi
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 2
4 Principe . 2
4.1 Méthode de recherche . 2
4.2 Méthode de dénombrement . 3
4.2.1 Ensemencement de trois ou cinq tubes de milieu sélectif liquide
d’enrichissement double concentration [5.3.1.1 a)] avec un volume égal
de l’échantillon pour essai si le produit à examiner est liquide, ou avec un
volume égal de suspension mère dans le cas d’autres produits. . 3
5 Diluants et milieux de culture . 3
5.1 Généralités . 3
5.2 Diluants . 3
5.3 Milieux de culture . 3
5.3.1 Milieu au glutamate modifié (milieu d’enrichissement sélectif) . 4
5.3.2 Gélose tryptone-bile-glucuronate (deuxième milieu sélectif) . 5
5.3.3 Essais de performance pour l’assurance qualité des milieux de culture . 5
6 Appareillage et verrerie . 6
7 Échantillonnage . 7
8 Préparation de l’échantillon pour essai . 7
9 Mode opératoire. 7
9.1 Méthode de recherche . 7
9.1.1 Prise d’essai, suspension mère et dilutions . 7
9.1.2 Incubation du milieu d’enrichissement sélectif . 7
9.1.3 Mise en subculture . 7
9.1.4 Incubation secondaire . . 7
9.1.5 Examen des boîtes . 7
9.1.6 Interprétation . 7
9.2 Méthode de dénombrement . 8
9.2.1 Prise d’essai, suspension mère et dilutions . 8
9.2.2 Ensemencement du milieu d’enrichissement sélectif . 8
9.2.3 Incubation . 8
9.2.4 Mise en subculture . 8
9.2.5 Deuxième incubation . 8
9.2.6 Examen des boîtes . 9
9.2.7 Interprétation . 9
10 Expression des résultats. 9
10.1 Méthode de recherche . 9
10.2 Méthode de dénombrement . 9
11 Fidélité . 9
12 Rapport d’essai . 9
Bibliographie .10
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ISO 16649-3:2015(F)

Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO, participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à
l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes
de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos –
Informations supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-
comité SC 9, Microbiologie.
Cette première édition annule et remplace l’ISO/TS 16649-3:2005, qui a fait l’objet d’une révision
technique.
L’ISO 16649 comprend les parties suivantes, sous le titre général Microbiologie de la chaîne alimentaire —
Méthode horizontale pour le dénombrement des Escherichia coli β-glucuronidase positive:
— Partie 1: Technique de comptage des colonies à 44 °C au moyen de membranes et de 5-bromo-4-chloro-
3-indolyl ß-D-glucuronate
— Partie 2: Technique de comptage des colonies à 44 °C au moyen de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-
glucuronate
— Partie 3: Technique du nombre le plus probable utilisant le 5-bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-glucuronate
La présente version corrigée de l’ISO 16649-3:2015 inclut les corrections suivantes:
— en 4.1.4, première ligne, «(22 ± 2) h» a été remplacé par «(21 ± 3) h»;
— en 4.2.5, première ligne, «(22 ± 2) h» a été remplacé par «(21 ± 3) h»;
— le Tableau 1 a été remplacé;
— le Tableau 2 a été remplacé;
— en 9.1.4, première ligne, «(22 ± 2) h» a été remplacé par «(21 ± 3) h»;
iv © ISO 2015 – Tous droits réservés

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ISO 16649-3:2015(F)

— en 9.2.5, première ligne, «(22 ± 2) h» a été remplacé par «(21 ± 3) h»;
— en 9.2.5, deuxième ligne, «trois» a été remplacé «six».
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ISO 16649-3:2015(F)

Introduction
En raison de la grande diversité des aliments destinés à la consommation humaine ou animale, la
présente méthode horizontale pourrait ne pas convenir en tous points pour certains produits. Dans
ce cas, différentes méthodes spécifiques de ces produits pourraient être utilisées si cela s’avère
absolument nécessaire pour des raisons techniques justifiées. Néanmoins, la méthode horizontale
devra être appliquée aussi souvent que possible.
Lors de la prochaine révision de la présente partie de l’ISO 16649, il sera tenu compte de toutes les
informations indiquant dans quelle mesure cette méthode horizontale a été suivie, ainsi que des raisons
des dérogations dans le cas de produits particuliers.
L’harmonisation de toutes les méthodes d’essai ne peut être réalisée de façon immédiate; de ce fait,
il peut déjà exister des normes internationales et/ou nationales pour certains groupes de produits,
qui ne concordent pas avec cette méthode horizontale. Lors de la prochaine révision de ces normes, il
serait souhaitable de les aligner avec la présente partie de l’ISO 16649 et de ne conserver que les seules
divergences justifiées indispensables pour des raisons techniques.
vi © ISO 2015 – Tous droits réservés

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NORME INTERNATIONALE ISO 16649-3:2015(F)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode
horizontale pour le dénombrement des Escherichia coli
bêta-glucuronidase positive —
Partie 3:
Recherche et technique du nombre le plus probable
utilisant le bromo-5-chloro-4-indolyl-3 ß-D-glucuronate
AVERTISSEMENT — La méthode décrite dans la présente partie de l’ISO 16649 ne permet pas de
détecter les souches d’Escherichia coli qui ne se développent pas à 44 °C et, en particulier, celles
qui sont β-glucuronidase négative, comme Escherichia coli O157 et quelques autres souches d’E.
coli pathogènes.
1 Domaine d’application
La présente partie de l’ISO 16649 spécifie une méthode horizontale pour la recherche et le
dénombrement des Escherichia coli β-glucuronidase positives par la technique de mise en culture en
milieu liquide et par le calcul du nombre le plus probable (NPP) après incubation à (37 ± 1) °C, puis à
(44 ± 1) °C. La présente partie de l’ISO 16649 est applicable:
— aux produits alimentaires destinés à la consommation humaine ou à l’alimentation des animaux;
— aux échantillons environnementaux dans la zone de production et de manutention des produits
alimentaires.
Cette méthode convient pour le dénombrement des cellules d’Escherichia coli qui ont pu souffrir de
déshydratation, de congélation, d’exposition à un environnement salin (marin par exemple) ou avoir été
endommagées par des désinfectants, par exemple des produits contenant du chlore.
L’applicabilité de la présente partie de l’ISO 16649 est limitée par le fait que la méthode est sujette à
une importante variabilité. Il faut appliquer la méthode et interpréter les résultats à la lumière des
informations fournies à l’Article 11.
Cette méthode n’a pas fait l’objet d’une évaluation complète pour toutes les matrices, par exemple pour
le lait et les produits laitiers, pour lesquels il convient d’utiliser l’ISO 7251.
2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 6887-1, Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension mère et des
dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique — Partie 1: Règles générales pour la préparation de
la suspension mère et des dilutions décimales.
ISO 6887-2, Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension mère et des
dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique — Partie 2: Règles spécifiques pour la préparation
des viandes et produits à base de viande.
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ISO 16649-3:2015(F)

ISO 6887-3, Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension mère et des
dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique — Partie 3: Règles spécifiques pour la préparation
des produits de la pêche.
ISO 6887-4, Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension mère et des
dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique — Partie 4: Règles spécifiques pour la préparation
de produits autres que les produits laitiers, les produits carnés et les produits de la pêche.
ISO 6887-5, Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension mère et des
dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique — Partie 5: Règles spécifiques pour la préparation
du lait et des produits laitiers.
ISO 6887-6, Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension mère et des
dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique — Partie 6: Règles spécifiques pour la préparation
des échantillons prélevés au stade de production primaire
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations.
ISO 11133, Microbiologie des aliments pour animaux et des eaux - Préparation, production, stockage et
essais de performance des milieux de culture
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
3.1
Escherichia coli β-glucuronidase positive
souches d’E. coli qui, à 44 °C, forment des colonies bleues ou bleu-vert caractéristiques sur le milieu
tryptone-bile-glucuronate (TBX) dans les conditions spécifiées dans le mode opératoire
3.2
dénombrement des Escherichia coli β-glucuronidase positive
détermination du nombre le plus probable d’E. coli β-glucuronidase positive, par millilitre ou par
gramme d’échantillon, lorsque l’essai est effectué selon le mode opératoire spécifié
4 Principe
4.1 Méthode de recherche
4.1.1 Ensemencement d’un milieu sélectif liquide d’enrichissement avec une quantité déterminée
de l’échantillon pour essai si le produit à examiner est liquide, ou avec une quantité déterminée de
suspension mère dans le cas d’autres produits.
4.1.2 Incubation du tube à (37 ± 1) °C pendant (24 ± 2) h. Examen du tube pour déceler une éventuelle
production d’acide, signifiant une fermentation du lactose.
4.1.3 Si le tube présente une production d’acide, mettre en subculture sur gélose tryptone-bile-
glucuronate (5.3.2).
4.1.4 Incubation de la gélose tryptone-bile-glucuronate (5.3.2) à (44 ± 1) °C pendant (21 ± 3) h.
Examen de la gélose tryptone-bile-glucuronate (5.3.2) pour déceler la présence éventu
...

PROJET DE NORME INTERNATIONALE ISO/DIS 16649-3
ISO/TC 34/SC 9 Secrétariat: AFNOR
Début de vote Vote clos le

2013-04-18 2013-09-18
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Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour le
dénombrement des Escherichia coli bêta-glucuronidase
positive —
Partie 3:
Technique du nombre le plus probable utilisant le bromo-5-
chloro-4-indolyl-3 beta-D-glucuronate
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of beta-glucuronidase-
positive Escherichia coli —
Part 3: Detection and most probable number technique using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronide
ICS 07.100.30


TRAITEMENT PARALLÈLE ISO/CEN
Le présent projet a été élaboré dans le cadre de l'Organisation internationale de normalisation (ISO)
et soumis selon le mode de collaboration sous la direction de l'ISO, tel que défini dans l'Accord de
Vienne.
Le projet est par conséquent soumis en parallèle aux comités membres de l'ISO et aux comités
membres du CEN pour enquête de cinq mois.
En cas d'acceptation de ce projet, un projet final, établi sur la base des observations reçues, sera
soumis en parallèle à un vote d'approbation de deux mois au sein de l'ISO et à un vote formel au sein
du CEN.

Pour accélérer la distribution, le présent document est distribué tel qu'il est parvenu du
secrétariat du comité. Le travail de rédaction et de composition de texte sera effectué au
Secrétariat central de l'ISO au stade de publication.
To expedite distribution, this document is circulated as received from the committee
secretariat. ISO Central Secretariat work of editing and text composition will be undertaken at
publication stage.

CE DOCUMENT EST UN PROJET DIFFUSÉ POUR OBSERVATIONS ET APPROBATION. IL EST DONC SUSCEPTIBLE DE MODIFICATION ET NE PEUT
ÊTRE CITÉ COMME NORME INTERNATIONALE AVANT SA PUBLICATION EN TANT QUE TELLE.
OUTRE LE FAIT D'ÊTRE EXAMINÉS POUR ÉTABLIR S'ILS SONT ACCEPTABLES À DES FINS INDUSTRIELLES, TECHNOLOGIQUES ET
COMMERCIALES, AINSI QUE DU POINT DE VUE DES UTILISATEURS, LES PROJETS DE NORMES INTERNATIONALES DOIVENT PARFOIS ÊTRE
CONSIDÉRÉS DU POINT DE VUE DE LEUR POSSIBILITÉ DE DEVENIR DES NORMES POUVANT SERVIR DE RÉFÉRENCE DANS LA
RÉGLEMENTATION NATIONALE.
LES DESTINATAIRES DU PRÉSENT PROJET SONT INVITÉS À PRÉSENTER, AVEC LEURS OBSERVATIONS, NOTIFICATION DES DROITS DE PRO-
PRIÉTÉ DONT ILS AURAIENT ÉVENTUELLEMENT CONNAISSANCE ET À FOURNIR UNE DOCUMENTATION EXPLICATIVE.
©  Organisation Internationale de Normalisation, 2013

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ISO/DIS 16649-3


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quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur l’internet ou sur un
Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à l’adresse ci-après ou au
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ISO/DIS 16649-3
Sommaire Page
Avant-propos . iv
Introduction . v
1 Domaine d'application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 2
4 Principe . 2
4.1 Méthode de détection . 2
4.2 Méthode de dénombrement . 3
5 Diluants et milieux de culture . 3
5.1 Diluants. 3
5.2 Milieux de culture . 4
5.2.1 Milieu au glutamate modifié (milieu d'enrichissement sélectif) . 4
5.2.2 Gélose tryptone-bile-glucuronate (deuxième milieu sélectif) . 5
5.2.3 Essais de performance pour l'assurance qualité des milieux de culture. 5
6 Appareillage et verrerie . 6
7 Échantillonnage . 6
8 Préparation de l’échantillon pour essai . 7
9 Mode opératoire . 7
9.1 Méthode de détection . 7
9.1.1 Prise d'essai, suspension mère et dilutions . 7
9.1.2 Incubation . 7
9.1.3 Mise en subculture . 7
9.1.4 Deuxième incubation . 7
9.1.5 Examen des boîtes . 7
9.1.6 Interprétation . 7
9.2 Méthode de dénombrement . 7
9.2.1 Prise d'essai, suspension mère et dilutions . 7
9.2.2 Ensemencement du milieu d'enrichissement sélectif . 8
9.2.3 Incubation . 8
9.2.4 Mise en subculture . 8
9.2.5 Deuxième incubation . 8
9.2.6 Examen des boîtes . 8
9.2.7 Interprétation . 8
10 Expression des résultats . 9
10.1 Méthode de détection . 9
10.2 Méthode de dénombrement . 9
11 Fidélité . 9
12 Rapport d’essai . 9
Bibliographie . 10

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ISO/DIS 16649-3
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 16649-3 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9,
Microbiologie.
L'ISO 16649 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Microbiologie des aliments —
Dénombrement des Escherichia coli ß-glucuronidase-positive :
 Partie 1 : Technique de comptage des colonies à 44 °C au moyen de membranes et de 5-bromo-4-
chloro- 3-indolyl ß-D-glucuronate
 Partie 2 : Technique de comptage des colonies à 44 °C au moyen de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-
glucuronate
 Partie 3: Détection et technique du nombre le plus probable au moyen de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-
glucuronate
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ISO/DIS 16649-3
Introduction
En raison de la grande diversité des aliments destinés à la consommation humaine ou animale, la présente
méthode horizontale peut ne pas convenir pour certains produits. Dans ce cas, différentes méthodes
spécifiques de ces produits peuvent être utilisées lorsque cela s'avère absolument nécessaire pour des
raisons techniques justifiées. Néanmoins, la méthode horizontale devra être appliquée aussi souvent que
possible.
Lors de la prochaine révision de la présente Norme internationale, il sera tenu compte de toutes les
informations indiquant dans quelle mesure cette méthode horizontale a été suivie, ainsi que des raisons des
dérogations dans le cas de produits particuliers.
L'harmonisation de toutes les méthodes d'essai ne peut être réalisée de façon immédiate ; de ce fait, il peut
déjà exister des normes internationales et/ou nationales pour certains groupes de produits, qui ne concordent
pas avec cette méthode horizontale. Lors de la prochaine révision de ces normes, il serait souhaitable de les
aligner avec la présente norme internationale de sorte que les seules divergences éventuelles restantes
soient celles nécessaires pour des raisons techniques bien établies.

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PROJET DE NORME INTERNATIONALE ISO/DIS 16649-3

Microbiologie des aliments — Dénombrement des Escherichia
coli ß-glucuronidase-positive — Partie 3: Détection et technique
du nombre le plus probable au moyen de 5-bromo-4-chloro-3-
indolyl ß-D-glucuronate
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie une méthode horizontale pour la détection et le dénombrement des
Escherichia coli -glucuronidase positive par la technique de mise en culture en milieu liquide et par le calcul
du nombre le plus probable (NPP) après incubation à 37 °C, puis à 44 °C. La présente Norme internationale
est applicable :
 aux produits alimentaires destinés à la consommation humaine ou à l'alimentation des animaux ; et
 aux échantillons environnementaux dans la zone de production et de manutention des produits
alimentaires.
Cette méthode convient pour le dénombrement des cellules d'Escherichia coli qui ont pu souffrir de
déshydratation, de congélation, d'exposition à un environnement salin (marin par exemple) ou avoir été
endommagées par des désinfectants, par exemple des produits contenant du chlore.
L'applicabilité de la présente Norme internationale est limitée par le fait que la méthode est sujette à une
importante variabilité. Il convient d'appliquer la méthode et d'interpréter les résultats à la lumière des
informations fournies à l'Article 11.
Cette méthode n'a pas fait l'objet d'une évaluation complète pour toutes les matrices, par exemple pour le lait
et les produits laitiers, pour lesquels il convient d'utiliser l'ISO 7251.
AVERTISSEMENT — La méthode décrite dans la présente Norme internationale ne permet pas de
détecter les souches d'Escherichia coli qui ne se développent pas à 44 °C et, en particulier, celles qui
sont -glucuronidase négative, comme Escherichia coli O157 et quelques autres souches d'E. coli
pathogènes.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 6887-1, Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension mère et des
dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique — Partie 1 : Règles générales pour la préparation de
la suspension mère et des dilutions décimales.
ISO 6887-2, Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension mère et des
dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique — Partie 2 : Règles spécifiques pour la préparation
des viandes et produits à base de viande.
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ISO/DIS 16649-3
ISO 6887-3, Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension mère et des
dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique — Partie 3 : Règles spécifiques pour la préparation
des produits de la pêche.
ISO 6887-4, Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension mère et des
dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique — Partie 4 : Règles spécifiques pour la préparation
de produits autres que les produits laitiers, les produits carnés et les produits de la pêche.
ISO 6887-5, Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension mère et des
dilutions décimales en vue de l’examen microbiologique — Partie 5 : Règles spécifiques pour la préparation
du lait et des produits laitiers.
ISO 7251, Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche et le dénombrement
d'Escherichia coli présumés — Technique du nombre le plus probable.
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations.
ISO TS 11133-1, Microbiologie des aliments — Lignes directrices pour la préparation et la production des
milieux de culture — Partie 1 : Lignes directrices générales d'assurance qualité pour la préparation des
milieux de culture en laboratoire.
ISO TS 11133-2, Microbiologie des aliments — Guide pour la préparation et la production des milieux de
culture — Partie 2 : Guide général pour les essais de performance des milieux de culture.
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
Escherichia coli -glucuronidase positive
bactéries qui, à 44 °C, forment des colonies bleues ou bleues-vertes caractéristiques sur le milieu tryptone-
bile-glucuronate dans les conditions spécifiées dans la présente partie de l'ISO 16649
3.2
dénombrement des Escherichia coli -glucuronidase positive
détermination du nombre le plus probable d'Escherichia coli -glucuronidase positive, par millilitre ou par
gramme d'échantillon, lorsque l'essai est effectué selon la méthode spécifiée dans la présente partie de
l'ISO 16649
4 Principe
4.1 Méthode de détection
4.1.1 Ensemencement d'un milieu sélectif liquide d'enrichissement avec une quantité déterminée de
l'échantillon pour essai si le produit à examiner est liquide, ou avec une quantité déterminée de suspension
mère dans le cas d'autres produits.
4.1.2 Incubation du tube à 37 °C pendant 24 h. Examen du tube pour déceler une éventuelle production
d'acide, signifiant une fermentation du lactose.
4.1.3 Si le tube présente une production d'acide, mettre en subculture sur gélose tryptone-bile-
glucuronate [5.2.2].
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ISO/DIS 16649-3
4.1.4 Incubation de la gélose tryptone-bile-glucuronate [5.2.2] à 44 °C pendant 20 h à 24 h. Examen de la
gélose tryptone-bile-g
...