ISO 19020:2017
(Main)Microbiology of the food chain — Horizontal method for the immunoenzymatic detection of staphylococcal enterotoxins in foodstuffs
Microbiology of the food chain — Horizontal method for the immunoenzymatic detection of staphylococcal enterotoxins in foodstuffs
ISO 19020:2017 specifies a screening method for the detection of staphylococcal enterotoxins SEA, SEB, SECs, SED and SEE in foodstuffs. It consists of two main steps: a) extraction followed by a concentration based on dialysis principle; and b) an immunoenzymatic detection using commercially available detection kits. ISO 19020:2017 is applicable to the screening of staphylococcal enterotoxins SEA to SEE in products intended for human consumption. Other staphylococcal enterotoxins such as types SEG, SEH, SEI, SER, SES and SET can also cause illness. Due to the lack of commercially available detection kits, ISO 19020:2017 is applicable only to types SEA to SEE, but may apply to other types of toxins, subject to validation of the method.
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale de détection des entérotoxines staphylococciques par test immuno-enzymatique dans les aliments
L'ISO 19020:2017 décrit une méthode de recherche pour la détection des entérotoxines staphylococciques SEA, SEB, SEC, SED et SEE dans les aliments. Elle se compose de deux étapes principales: a) une extraction suivie d'une concentration basée sur le principe de la dialyse; et b) une détection immuno-enzymatique au moyen de trousses de détection disponibles dans le commerce. L'ISO 19020:2017 s'applique à la recherche des entérotoxines staphylococciques SEA à SEE dans les produits destinés à la consommation humaine. D'autres entérotoxines staphylococciques, telles que les types SEG, SEH, SEI, SER, SES et SET, peuvent également provoquer des intoxications alimentaires. En raison de l'absence de trousses de détection disponibles dans le commerce, l'ISO 19020:2017 ne s'applique qu'aux types SEA à SEE, mais peut s'appliquer à d'autres types de toxines, sous réserve de validation de la méthode.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 19020
First edition
2017-06
Microbiology of the food chain —
Horizontal method for the
immunoenzymatic detection of
staphylococcal enterotoxins in
foodstuffs
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode horizontale de
détection des entérotoxines staphylococciques par test immuno-
enzymatique dans les aliments
Reference number
ISO 19020:2017(E)
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ISO 19020:2017(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle . 2
5 Reagents . 2
6 Apparatus . 2
7 Sampling . 3
8 Procedure . 3
8.1 Preparation of test portion . 3
8.2 Storage of the test sample . 3
8.3 Extraction . 4
8.4 Concentration of the extract (mandatory for milk and dairy products) . 5
8.5 Recovery of the concentrated extract . 5
8.6 Storage and steps before detection . 6
8.7 Detection . 6
8.8 Performance criteria . 6
9 Quality control . 6
10 Expression of results . 7
11 Confirmation . 7
12 Performance characteristics of the method . 7
13 Test report . 9
Annex A (informative) Results of interlaboratory studies: 2013.10
Annex B (informative) Results of interlaboratory studies: 2014.15
Annex C (informative) Note on interferences .21
Bibliography .22
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ISO 19020:2017(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation on the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see the following
URL: w w w . i s o .org/ iso/ foreword .html.
This document was prepared by the European Committee for Standardization (CEN) Technical
Committee CEN/TC 275, Food Analysis — Horizontal methods, in collaboration with ISO Technical
Committee TC 34, Food products, Subcommittee SC 9, Microbiology, in accordance with the agreement
on technical cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
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ISO 19020:2017(E)
Introduction
Staphylococcal enterotoxins (SEs) are proteins that can be produced in foods, by certain strains of the
coagulase positive staphylococci (CPS), mainly Staphylococcus aureus. These SEs are heat and acid stable
toxins that cause nausea, vomiting, abdominal pain and diarrhoea when ingested. Due to their stability
SEs might still be present even when coagulase positive staphylococci cannot be detected. SEs consist
of a family of more than 20 structurally-related globular monomeric proteins with molecular weights
[1]
of 19 kDa to 30 kDa. These proteins are relatively stable under changing environmental conditions,
such as heat treatment, freezing and change in pH; moreover, they are resistant to proteolytic
digestion. Typically, and depending on the sensitivity of affected individuals, nanogram (ng) amounts of
enterotoxin can cause intoxication with the symptoms described above. Due to the influence of SEs on
human health, the European Union has adopted legislation in order to increase consumer protection by
[2]
defining microbiological criteria for foodstuffs, such as CPS enumeration and detection of SEs.
Several methods have been developed for the detection and/or quantification of SEs. Some of these
methods are based on enzyme immunoassay (EIA). Other methods are based on the chemical analysis
using liquid chromatography with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) for the detection and
quantification of SEs. As these latter methods are currently under development, EIA methods have been
chosen as the starting point for standardization of a detection method for SEs.
The aim is to detect SEs using commercially available test kits. This document describes the protocol
for the extraction of SEs from food samples. Moreover, criteria for the performance of the kits have
been evaluated on five types of food matrices before use based on the criteria given in this document.
Response rates of different staphylococcal food poisoning outbreaks were modelled as a function of
[3]
ingested doses. For this purpose, data from the literature as well as data from the European Union
Reference Laboratory for CPS were used.
The United States Environmental Protection Agency (US EPA) benchmark dose methodology was
[4]
applied to this data set and helped to establish the benchmark dose (BMD). The BMD is defined as the
dose of a hazard (staphylococcal enterotoxin) likely to trigger health symptoms in a given percentage of
the exposed population. The BMD lower limit (BMDL) is the lower 95 % (or 90 %) confidence interval of
the BMD. This value was used to set up the acceptable value for the limit of detection 50 (LOD ) of the
50
various commercially available SE detection kits.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 19020:2017(E)
Microbiology of the food chain — Horizontal method
for the immunoenzymatic detection of staphylococcal
enterotoxins in foodstuffs
1 Scope
This document specifies a screening method for the detection of staphylococcal enterotoxins SEA, SEB,
SECs, SED and SEE in foodstuffs. It consists of two main steps: a) extraction followed by a concentration
based on dialysis principle; and b) an immunoenzymatic detection using commercially available
detection kits.
This document is applicable to the screening of staphylococcal enterotoxins SEA to SEE in products
intended for human consumption.
Other staphylococcal enterotoxins such as types SEG, SEH, SEI, SER, SES and SET can also cause illness.
Due to the lack of commercially available detection kits, this document is applicable only to types SEA
to SEE, but may apply to other types of toxins, subject to validation of the method.
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 3696, Water for analytical laboratory use — Specification and test methods
ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for
microbiological examinations
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
— ISO Online browsing platform: available at http:// www .iso .org/ obp
3.1
staphylococcal enterotoxin A, B, C, D, E
SEA, SEB, SEC, SED, SEE
exoprotein SEA, SEB, SEC, SED and SEE produced by enterotoxigenic strains of coagulase positive
staphylococci, mainly Staphylococcus aureus with a molecular weight ranging from 19 kDa to 30 kDa
3.2
specificity
SP
number of samples found to be negative divided by the total number of blank samples tested
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ISO 19020:2017(E)
3.3
sensitivity
SE
number of samples found to be positive divided by the total number of samples tested at a given level of
contamination
3.4
limit of detection 50
LOD
50
concentration (ng SE/g) for which the probability of detection is 50 %
3.5
benchmark dose
BMD
dose of a hazard (e.g. staphylococcal enterotoxin) likely to trigger health symptoms in a given
percentage of the exposed population
4 Principle
This document specifies a method for the detection of staphylococcal enterotoxins (SEA to SEE) in all
foodstuffs, consisting of two main steps: a) extraction followed by a concentration based on dialysis
principle; and b) an immunoenzymatic detection using commercially available detection kits.
5 Reagents
Use only reagents of recognized analytical grade, unless otherwise specified.
5.1 Distilled or demineralized water or water of equivalent quality according to ISO 3696.
5.2 Hydrochloric acid (e.g. concentrations 5N, 1N or other dilutions).
5.3 Sodium hydroxide (e.g. concentrations 5N, 1N or other dilutions).
5.4 PBS (phosphate buffered saline), pH 7,3 ± 0,2 [NaCl/Na HPO : 145 mM/10 mM].
2 4
5.5 PEG, molecular weight 20 000 g/mol (PolyEthylene Glycol) solution.
Prepare a concentrated PEG solution: weigh 30 g of PEG powder, and add 70 ml of water (5.1).
5.6 Electrode cleaning solution (e.g. ethanol 70 %).
5.7 Immunoenzymatic detection kit dedicated to SEs. Any kit shall comply with the performance
criteria in 8.7.
6 Apparatus
Usual microbiological laboratory equipment (in accordance with ISO 7218) and, in particular, the
following.
6.1 Blender.
6.2 Balance.
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6.3 Homogenization equipment, e.g. rotary homogenizer, blender or peristaltic homogenizer.
It is highly recommended to use a rotary homogenizer, in particular for all types of food difficult to mix in
order to obtain a homogeneous sample. If a peristaltic homogenizer is used, only use bags without filter.
6.4 Shaker at room temperature, e.g. orbital shaker, magnetic stirrer, etc.
6.5 pH-meter and electrode, e.g. combination electrode.
6.6 Centrifuge, capable of operating at 3 130g minimum; if possible, capable of being refrigerated.
6.7 Dialysis membrane, molecular weight cut off (MWCO) of 6 000 Da to 8 000 Da.
6.8 Closures for dialysis membrane.
6.9 Filtering material, e.g. funnel and cotton-wool, glass-wool, etc.
6.10 Shallow tray.
6.11 Refrigerator (3 °C ± 2 °C or 5 °C ± 3 °C) and freezer (≤ −18 °C).
6.12 Laboratory ware in glass or polypropylene to avoid the adsorption of toxins (funnel, beaker,
vial, centrifuge tube, etc.).
6.13 Equipment suitable for the detection kit used, see 5.7.
6.14 Water bath (38 °C ± 2 °C).
7 Sampling
Sampling is not part of the method specified in this document.
8 Procedure
8.1 Preparation of test portion
In the case of cheese with rind, take about 10 % of rind and 90 % of core.
As enterotoxins can be heterogeneously distributed in the sample, if possible, mix and homogenize the
whole sample or a representative part of it with a blender (6.1). Use 25 g of the homogenized sample as
the test portion.
In the case of a suspected staphylococcal food poisoning outbreak (SFPO), the test sample size may be
less than 25 g. Perform the analysis as described below and adapt the steps 8.3.1 to 8.5.2 accordingly.
The ratio of the weight of the test portion and concentrated extract (8.5.2) should be approximately five
[e.g. 25 g test portion for 5,0 g to 5,5 g (maximum 5,8 g for the sticky extracts) of concentrated extract,
12,5 g test portion for 2,5 g to 2,8 g (maximum 2,9 g for the sticky extracts) of concentrated extract].
8.2 Storage of the test sample
It is recommended to store the samples at 3 °C ± 2 °C or 5 °C ± 3 °C (6.11) before analysis.
If analysis is not performed within 24 h, it is possible to freeze the samples. In this case, completely
thaw the samples at 3 °C ± 2 °C or 5 °C ± 3 °C before starting the analysis.
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To avoid loss of toxins, it is highly recommended not to freeze and thaw the samples repeatedly before
analysis.
8.3 Extraction
8.3.1 Add approximately 40 ml of water (5.1) at 38 °C ± 2 °C to the 25 g test portion, except in the case
of liquid products. For liquid products, proceed directly as described in 8.3.2. In the case of SFPO, if the
test portion is smaller than 25 g, reduce the amount of water (5.1) with the equal ratio.
Homogenize the mixture using a rotary homogenizer or a blender (6.3). This step is particularly
important in the case of high fat content products. It is recommended to use a rotary homogenizer for
all types of food samples that are difficult to mix in order to obtain a homogeneous sample.
8.3.2 Recover the entire sample and rinse the system (stem of the rotary homogenizer, the stomacher
bag or the bowl of the blender) with a minimal volume of water (5.1).
NOTE The greater the volume of liquid used the longer the length of dialysis membrane required.
8.3.3 Allow the toxins to diffuse by shaking the sample (6.4) at room temperature (18 °C to 27 °C) for
30 min to 60 min.
8.3.4 Acidify the mixture with appropriate hydrochloric acid solutions (5.2) in order to obtain a pH
between 3,5 and 4,0 measured with a pH meter (6.5).
8.3.5 Centrifuge the entire mixture at 3 130g minimum for 15 min under refrigeration temperature
(approximately 4 °C) or at room temperature (18 °C to 27 °C) (6.6).
In the case of fatty samples, a centrifugation at refrigeration temperature (approximately 4 °C) is
recommended to eliminate the fat particles before the dialysis.
8.3.6 Recover the supernatant in a beaker (6.12). If the supernatant is opaque, repeat centrifugation as
described in 8.3.5. After centrifugation pH shall be between 3,0 and 4,5.
If the pH > 4,5, proceed as described in 8.3.4.
If the pH < 3,0, the 3D structure of SEs might be damaged. Take another 25 g test portion and proceed
as described in 8.3.1.
8.3.7 Neutralize the mixture with the appropriate sodium hydroxide solutions (5.3) in order to obtain
a pH between 7,4 and 7,6.
If pH > 9,0, the 3D structure of SEs might be damaged. Take another 25 g test portion and proceed as
described in 8.3.1.
8.3.8 Centrifuge according to 8.3.5.
8.3.9 Recover the entire neutralised aqueous phase for the concentration step.
To recover the maximum amount of toxins, at the end of the acidification and neutralization steps, rinse
the electrode and beaker with some drops of water (5.1).
In the case of high fat content samples, the electrode can be cleaned using ethanol 70 % (5.6) to dissolve
fat particles after the analysis is complete.
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8.3.10 Alternative extraction procedure (optional).
This alternative procedure may only be used in limited circumstances, such as a suspected food
poisoning event, and may not be used for milk and milk products. This alternative procedure differs
from the described procedure by omitting the dialysis concentration step.
— Take the necessary volume (depending on the kit used) of the neutralized aqueous phase obtained
in step 8.3.9 and proceed to the detection step 8.7. Store the remaining neutralized aqueous phase
at 3 °C ± 2 °C or 5 °C ± 3 °C.
— If a SEs-negative result is obtained, implement the concentration step (8.4) of the remaining
neutralized aqueous phase the same day and repeat the detection using the concentrated extract.
If this procedure is not strictly followed, a new test portion should be analysed.
8.4 Concentration of the extract (mandatory for milk and dairy products)
8.4.1 For each sample, use the PEG solution prepared according to 5.5.
8.4.2 Cut a piece of dialysis membrane (6.7) with sufficient length to contain the entire extract.
8.4.3 Soak the membrane in water (5.1) for rehydration, following the manufacturer’s instructions
(e.g. at least for 30 min at room temperature).
Before use, rinse the membrane (outside and inner parts) with water (5.1).
8.4.4 Lock one end of the membrane with a closure (6.8).
8.4.5 Fill the prepared membrane with all of the neutralized aqueous phase (8.3.9) using a funnel
and a small piece of filtering material (6.9) to filter out suspended particles. Lock the other end of the
membrane with a second closure (6.8).
8.4.6 Lay down the filled dialysis membrane in a shallow tray (6.10) filled with the PEG solution (5.5).
8.4.7 Allow the extracts to concentrate, overnight at 3 °C ± 2 °C or 5 °C ± 3 °C (6.11). If the extract is not
concentrated enough (i.e. more than 5 ml left in the dialysis membrane), lay it down in the PEG solution
for more time (up to 3 days) or add some PEG powder over the membrane.
8.5 Recovery of the concentrated extract
8.5.1 Take the dialysis membrane out of the PEG solution and rinse the outer-parts of the membrane
with water (5.1) to remove all traces of PEG solution.
8.5.2 Open one end of the membrane and recover the concentrated extract by rinsing thoroughly the
inner-part of the dialysis membrane using
— PBS (5.4) in the case of milk and dairy products, or
— water (5.1) in the case of other matrices.
Rinse thoroughly the inner-parts of the dialysis membrane to obtain a final concentrated extract mass
ranging from 5,0 g to 5,5 g (maximum 5,8 g for the sticky extracts).
Carefully transfer the concentrated extract into a glass or polypropylene vial (6.12).
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During this critical step, to recover the maximum amount of enterotoxins it is recommended
— to rub the inner-parts of the dialysis membrane (one part against another inner-part) in order to
remove and to recover the maximum of SEs, and
— to maximize the quantity of SEs recovered, carry out the recovery of the extract by repeatedly
adding small quantities of PBS (5.4) or water (5.1) into the membrane (e.g. add 1 ml or 2 ml), rubbing
the membrane as described above and adding the recovered extract into the vial. Repeat these steps
until a final mass of 5,0 g to 5,5 (5,8) g per 25 g test portion is obtained.
In the case of a SFPO, the mass of the sample analysed may be lower than 25 g (8.2). The final mass of the
concentrated extract (8.5.2) will be adjusted to obtain a final ratio of 1 to 5 between the concentrated
extract mass and the test portion mass.
8.6 Storage and steps before detection
If the concentrated extract (8.5.2) will be analysed within 48 h, store it at 3 °C ± 2 °C or 5 °C ± 3 °C (6.11).
If the detection cannot be performed within 48 h, store the extract at ≤ −18 °C (6.11) unless otherwise
stated by the manufacturer of the detection kit used.
In the case of frozen extract, completely thaw and homogenize it using a vortex before performing the
detection step.
If foaming appears, make sure to pipet in the liquid phase.
8.7 Detection
Select a detection kit that fulfils the performance criteria (sensitivity, specificity, LOD ) for the entire
50
procedure, defined in this document (see 8.8).
Carefully follow the manufacturer’s instructions for the detection step of the kit used.
8.8 Performance criteria
Performance criteria including specificity (SP, 3.2), sensitivity (SE, 3.3), limit of detection 50 % (LOD ,
50
3.4) have been defined for the entire procedure, including extraction and detection. The calculation for
LOD was performed using a dedicated programme available from the ISO website.
50
The performance criteria that the commercial kits shall achieve are defined as follows:
— SP and SE should be higher than 90 %.
— LOD should be less than 0,06 ng SEs/g. This value is based on the estimated BMD for SEA of 6,1 ng
50
and the assumed ingestion of 100 g of food.
As consolidated data were only available for SEA, the staphylococcal enterotoxin most frequently
[4]
involved in SFPO, it was decided to use this value for the other toxin types SEB to SEE.
Values obtained by different detection kits and food matrices with and without dialysis are presented
in Clause 12. Laboratories shall refer to the data obtained to perform the selection of the detection kit
which fulfils the criteria mentioned above.
The data are summarized in Annexes A and B for the interlaboratory studies organized in 2013 and
2014, respectively. The values derived from the interlaboratory studies may not be applicable to food
types other than those given in Annexes A and B.
9 Quality control
It is recommended to check the entire procedure, with reference materials. An example of a suitable
reference material is given in Reference [5].
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10 Expression of results
Express the results of the screening method as
— staphylococcal enterotoxins SEA to SEE detected in x g of the test portion, or
— staphylococcal enterotoxins SEA to SEE not detected in x g of the test portion.
11 Confirmation
For a positive result obtained with or without dialysis concentration, it is recommended that a related
sample is analysed for confirmatory purposes, using a different method than the one described in this
document, as it is well known that interferences may occur (see Annex C).
12 Performance characteristics of the method
The performance characteristics of the method were determined in interlaboratory studies to evaluate
the specificity, sensitivity and the LOD of the method.
50
Data obtained for specificity, sensitivity and LOD are presented on Tables 1, 2 and 3, respectively.
50
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Table 1 — Specificity (%) values obtained by the three kits tested on the five food categories
Matrices Detection kits +DC -DC
a
Vidas SET2 100 100
Ready to eat food
b
Ridascreen SET Total 100 100
(RTE)
(SEA) c
Tecra Staph VIA 90 100
Vidas SET2 100 100
Fish product
Ridascreen SET Total 100 100
(SEC)
Tecra Staph VIA 100 80
Vidas SET2 100 100
Dessert
Ridascreen SET Total 100 100
(SEE)
Tecra Staph VIA 100 100
Vidas SET2 98
Cheese
Ridascreen SET Total 100 Not performed
(SED)
Tecra Staph VIA 100
Vidas SET2 100 100
Meat product
Ridascreen SET Total 100 100
(SEA)
Tecra Staph VIA 93 100
Key
+ DC: With dialysis concentration.
-DC: Without dialysis concentration.
a
Vidas SET2 is a product available commercially and supplied by bioMérieux SA, Marcy l’Etoile, France. This information
is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of these products.
b
Ridascreen SET Total is a product available commercially and supplied by R-biopharm AG, Darmstadt, Germany. This
information is given for the convenience of users of this document and does not constitute an endorsement by ISO of these
products.
c
Tecra Staph VIA was a product available commercially and supplied by 3M, Saint Paul, MN, United States. It has been
withdrawn from the market. This information is given for the convenience of users of this document and does not constitute
an endorsement by ISO of these products.
Table 2 — Sensitivity (%) values obtained by the three kits tested on the five food categories
RTE (SEA) Fish (SEC) Dessert (SEE) Cheese (SED) Meat (SEA)
kit level +DC -DC +DC -DC +DC -DC +DC -DC +DC -DC
L1 100 87 100 3 100 1 100 — 100 99
Vidas
SET2
L2 100 100 100 68 100 86 100 — 100 100
L1 98 10 98 10 94 0 87 — 100 37
Ridascreen
SET total
L2
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 19020
Première édition
2017-06
Microbiologie de la chaîne
alimentaire — Méthode horizontale
de détection des entérotoxines
staphylococciques par test immuno-
enzymatique dans les aliments
Microbiology of the food chain — Horizontal method for the
immunoenzymatic detection of staphylococcal enterotoxins in
foodstuffs
Numéro de référence
ISO 19020:2017(F)
©
ISO 2017
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ISO 19020:2017(F)
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Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
5 Réactifs . 2
6 Matériel . 2
7 Échantillonnage . 3
8 Mode opératoire. 3
8.1 Préparation de la prise d’essai . 3
8.2 Conservation de l’échantillon pour essai . 4
8.3 Extraction . 4
8.4 Concentration de l’extrait (obligatoire pour le lait et les produits laitiers) . 5
8.5 Récupération de l’extrait concentré . 5
8.6 Conservation et étapes à suivre avant la détection . 6
8.7 Détection . 6
8.8 Critères de performance . 6
9 Contrôle de la qualité . 7
10 Expression des résultats. 7
11 Confirmation . 7
12 Caractéristiques de performance de la méthode . 7
13 Rapport d’essai . 9
Annexe A (informative) Résultats des études interlaboratoires: 2013 .10
Annexe B (informative) Résultats des études interlaboratoires: 2014 .14
Annexe C (informative) Note concernant les interférences .20
Bibliographie .21
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ISO 19020:2017(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso. org/d irectives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www. iso. org/br evets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: ww w .iso. org/iso / fr/avant - propos. html.
Le présent document a été élaboré par le comité technique CEN/TC 275, Analyses alimentaires —
méthodes horizontales, du Comité européen de normalisation (CEN) en collaboration avec le comité
technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9, Microbiologie, conformément à l’accord de
coopération technique entre l’ISO et le CEN (Accord de Vienne).
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ISO 19020:2017(F)
Introduction
Les entérotoxines staphylococciques (ES) sont des protéines qui peuvent être produites dans les aliments
par certaines souches de staphylocoques à coagulase positive (SCP), essentiellement Staphylococcus
aureus. Ces ES sont des toxines stables à la chaleur et aux acides pouvant provoquer des nausées, des
vomissements, des douleurs abdominales et des diarrhées en cas d’ingestion. En raison de leur stabilité,
les ES peuvent être présentes même lorsque des staphylocoques à coagulase positive ne peuvent pas
être détectés. Les ES représentent une famille de plus de 20 protéines monomériques globulaires
[1]
structurellement liées de masse moléculaire de 19 kDa à 30 kDa . Ces protéines sont relativement
stables dans des conditions environnementales changeantes, comme le traitement thermique, la
congélation et les variations de pH; en outre, elles sont résistantes à la digestion protéolytique.
Typiquement, et selon la sensibilité des personnes concernées, une quantité d’entérotoxines de l’ordre
des nanogrammes (ng) peut provoquer une intoxication avec les symptômes décrits ci-dessus. Compte
tenu de leur pouvoir pathogène pour l’homme, l’Union européenne a adopté une législation afin
d’améliorer la protection des consommateurs en définissant des critères microbiologiques pour les
[2]
aliments, comme le dénombrement des SCP et la détection des ES .
Plusieurs méthodes ont été développées pour détecter et/ou quantifier les ES. Certaines de ces méthodes
sont de type immuno-enzymatique (EIA). D’autres méthodes sont basées sur une analyse chimique par
chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) pour détecter et
quantifier les ES. Ces dernières méthodes étant en cours de développement, les méthodes EIA ont été
choisies comme point de départ pour la normalisation d’une méthode de détection des ES.
Le but est de détecter les ES au moyen de trousses de diagnostic disponibles dans le commerce. Le présent
document décrit le protocole permettant d’extraire les ES à partir d’échantillons alimentaires. En outre,
les critères de performance de ces trousses ont été évalués avant utilisation sur cinq types de matrices
alimentaires, sur la base des critères fournis dans le présent document.
Les taux de réponse issus de différentes toxi-infections alimentaires à staphylocoques ont été modélisés
[3]
en fonction des doses ingérées. Pour cela, des données tirées de la littérature ainsi que des données
fournies par le Laboratoire de Référence de l’Union européenne pour les SCP ont été utilisées.
La méthodologie de «benchmark dose» de l’Agence de protection environnementale des États-Unis
(US EPA) a été appliquée à cet ensemble de données et a servi à établir la Bench Mark Dose (BMD).
[4]
La BMD est définie comme la dose d’un danger (entérotoxine staphylococcique) susceptible de
déclencher des symptômes dans un pourcentage donné de la population exposée. La limite inférieure
de la BMD (BMDL) est la limite inférieure de l’intervalle de confiance à 95 % (ou 90 %) de la BMD.
Cette valeur a été utilisée pour fixer la valeur acceptable du niveau de détection relatif 50 (LOD ) des
50
diverses trousses de détection des ES disponibles dans le commerce.
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NORME INTERNATIONALE ISO 19020:2017(F)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Méthode
horizontale de détection des entérotoxines
staphylococciques par test immuno-enzymatique dans les
aliments
1 Domaine d’application
Le présent document décrit une méthode de recherche pour la détection des entérotoxines
staphylococciques SEA, SEB, SEC, SED et SEE dans les aliments. Elle se compose de deux étapes
principales: a) une extraction suivie d’une concentration basée sur le principe de la dialyse; et b) une
détection immuno-enzymatique au moyen de trousses de détection disponibles dans le commerce.
Le présent document s’applique à la recherche des entérotoxines staphylococciques SEA à SEE dans les
produits destinés à la consommation humaine.
D’autres entérotoxines staphylococciques, telles que les types SEG, SEH, SEI, SER, SES et SET, peuvent
également provoquer des intoxications alimentaires. En raison de l’absence de trousses de détection
disponibles dans le commerce, le présent document ne s’applique qu’aux types SEA à SEE, mais peut
s’appliquer à d’autres types de toxines, sous réserve de validation de la méthode.
2 Références normatives
Les documents suivants cités dans le texte constituent, pour tout ou partie de leur contenu, des
exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 3696, Eau pour laboratoire à usage analytique — Spécification et méthodes d’essai
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/ ;
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse http:// www .iso .org/ obp.
3.1
entérotoxine staphylococcique A, B, C, D, E
SEA, SEB, SEC, SED, SEE
exoprotéine SEA, SEB, SEC, SED et SEE produite par des souches entérotoxinogènes de staphylocoques à
coagulase positive, essentiellement Staphylococcus aureus, de masse moléculaire comprise entre 19 kDa
et 30 kDa
3.2
spécificité
SP
nombre d’échantillons trouvés négatifs divisé par le nombre total d’échantillons blancs soumis à essai
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ISO 19020:2017(F)
3.3
sensibilité
SE
nombre d’échantillons trouvés positifs divisé par le nombre total d’échantillons soumis à essai à un
niveau donné de contamination
3.4
niveau de détection relatif 50 %
LOD
50
concentration (ng d’ES/g) pour laquelle la probabilité de détection est de 50
3.5
benchmark dose
BMD
dose d’un danger (entérotoxine staphylococcique, par exemple) susceptible de déclencher des
symptômes dans un pourcentage donné de la population exposée
4 Principe
Le présent document décrit une méthode pour la détection des entérotoxines staphylococciques (SEA à
SEE) dans tous les aliments; cette méthode est constituée de deux étapes principales: a) une extraction
suivie d’une concentration basée sur le principe de la dialyse; et b) une détection immuno-enzymatique
au moyen de trousses de détection disponibles dans le commerce.
5 Réactifs
Sauf spécification contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique reconnue.
5.1 Eau distillée ou déminéralisée ou eau de qualité équivalente conformément à l’ISO 3696.
5.2 Acide chlorhydrique (par exemple, concentrations 5N, 1N ou autres dilutions).
5.3 Hydroxyde de sodium (par exemple, concentrations 5N, 1N ou autres dilutions).
5.4 PBS (tampon phosphate, Phosphate Buffer Saline), pH 7,3 ± 0,2 [NaCl/Na HPO : 145 mM/10 mM].
2 4
5.5 PEG, solution de polyéthylène glycol de masse moléculaire égale à 20 000 g/mol.
Préparer une solution concentrée de PEG: peser 30 g de poudre de PEG et ajouter 70 ml d’eau (5.1).
5.6 Solution de nettoyage d’électrode (par exemple éthanol à 70 %).
5.7 Trousse de détection immuno-enzymatique dédiée aux ES. Les trousses doivent satisfaire aux
critères de performance énoncés en 8.7.
6 Matériel
Matériel de laboratoire de microbiologie (conforme à l’ISO 7218) et, en particulier, le matériel suivant.
6.1 Mélangeur.
6.2 Balance.
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ISO 19020:2017(F)
6.3 Équipement d’homogénéisation, par exemple homogénéisateur rotatif, mélangeur ou
homogénéisateur péristaltique.
Il est fortement recommandé d’utiliser un homogénéisateur rotatif, en particulier pour tous les
types d’aliments difficiles à broyer, pour obtenir un échantillon homogène. Avec un homogénéisateur
péristaltique, utiliser uniquement des sacs sans filtre.
6.4 Agitateur à température ambiante, par exemple, agitateur orbital, agitateur magnétique, etc.
6.5 pH-mètre et électrode, par exemple, électrode combinée.
6.6 Centrifugeuse, pouvant fonctionner à au moins 3 130g, si possible pouvant être réfrigérée.
6.7 Membrane de dialyse, ayant un seuil de rétention des molécules (MWCO) allant de 6 000 Da à
8 000 Da.
6.8 Pinces de fermeture pour membrane de dialyse.
6.9 Matériel de filtration, par exemple entonnoir et coton de verre, laine de verre, etc.
6.10 Plateau.
6.11 Réfrigérateur (à 3 °C ± 2 °C ou 5 °C ± 3 °C) et congélateur (≤ −18 °C).
6.12 Matériel de laboratoire en verre ou en polypropylène pour éviter l’adsorption des toxines
(entonnoir, bécher, flacon, tube de centrifugation…).
6.13 Équipement adapté à la trousse de détection utilisée, voir 5.7.
6.14 Bain d’eau (38 °C ± 2 °C).
7 Échantillonnage
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans le présent document.
8 Mode opératoire
8.1 Préparation de la prise d’essai
Dans le cas d’un fromage à croûte, prendre environ 10 % de croûte et 90 % de pâte.
Les entérotoxines pouvant être distribuées de manière hétérogène dans l’échantillon, si possible,
mixer et homogénéiser la totalité de l’échantillon ou une portion représentative de celui-ci à l’aide d’un
mélangeur (6.1). Utiliser 25 g d’échantillon homogénéisé comme prise d’essai.
En cas de suspicion d’une toxi-infection alimentaire à staphylocoques, la prise d’essai peut être
inférieure à 25 g. Réaliser l’analyse comme décrit ci-dessous et adapter les étapes 8.3.1 à 8.5.2 en
conséquence. Il convient que le rapport masse de la prise d’essai/masse de l’extrait concentré (8.5.2)
soit très proche de cette valeur [par exemple, 25 g de prise d’essai pour 5,0 g à 5,5 g (maximum 5,8 g
pour les extraits visqueux) d’extrait concentré, 12,5 g de prise d’essai pour 2,5 g à 2,8 g (maximum 2,9 g
pour les extraits visqueux) d’extrait concentré].
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8.2 Conservation de l’échantillon pour essai
Il est recommandé de conserver les échantillons à 3 °C ± 2 °C ou 5 °C ± 3 °C (6.11) avant analyse.
Si l’analyse ne peut pas être réalisée dans les 24 h, il est possible de congeler les échantillons. Dans ce
cas, décongeler totalement les échantillons à 3 °C ± 2 °C ou 5 °C ± 3 °C avant de commencer l’analyse.
Pour éviter la perte de toxines, il est fortement recommandé de ne pas congeler et décongeler les
échantillons de manière répétée avant l’analyse.
8.3 Extraction
8.3.1 Ajouter environ 40 ml d’eau (5.1) à 38 °C ± 2 °C aux 25 g de prise d’essai, sauf s’il s’agit de produits
liquides. Pour les produits liquides, procéder directement comme décrit en 8.3.2. En cas de toxi-infection
alimentaire à staphylocoques et pour une prise d’essai inférieure à 25 g, réduire la quantité d’eau (5.1)
selon le rapport égal.
Homogénéiser le mélange à l’aide d’un homogénéisateur rotatif ou d’un mélangeur (6.3). Cette étape
est particulièrement importante dans le cas des produits à teneur élevée en matière grasse. Il est
recommandé d’utiliser un homogénéisateur rotatif pour tous les types d’échantillons alimentaires
difficiles à broyer, pour obtenir un échantillon homogène.
8.3.2 Récupérer la totalité de l’échantillon et rincer le système (tige de l’homogénéisateur rotatif,
sac du Stomacher ou bol du mélangeur) avec un volume minimum d’eau distillée (5.1).
NOTE Plus le volume de liquide utilisé est important, plus la membrane de dialyse doit être longue.
8.3.3 Laisser les toxines diffuser en agitant l’échantillon (6.4) à température ambiante (de 18 °C à
27 °C) pendant 30 min à 60 min.
8.3.4 Acidifier le mélange avec des solutions d’acide chlorhydrique appropriées (5.2) afin d’obtenir
un pH compris entre 3,5 et 4,0, mesuré à l’aide d’un pH-mètre (6.5).
8.3.5 Centrifuger la totalité du mélange à 3 130 g minimum pendant 15 min à température de
réfrigération (environ 4 °C) ou à température ambiante (de 18 °C à 27 °C) (6.6).
En cas d’échantillons gras, une centrifugation à température de réfrigération (environ 4 °C) est
recommandée pour éliminer les particules de matière grasse avant la dialyse.
8.3.6 Récupérer le surnageant dans un bécher (6.12). Si le surnageant est opaque, répéter la
centrifugation comme décrit en 8.3.5. Après centrifugation, le pH doit être compris entre 3,0 et 4,5.
Si le pH est > 4,5, procéder à une nouvelle acidification comme décrit en 8.3.4.
Si le pH est < 3,0, la structure tridimensionnelle des ES est susceptible d’être endommagée. Réaliser une
autre prise d’essai de 25 g et procéder comme décrit en 8.3.1.
8.3.7 Neutraliser le mélange avec des solutions d’hydroxyde de sodium appropriées (5.3) afin d’obtenir
un pH compris entre 7,4 et 7,6.
Si le pH est > 9,0, la structure tridimensionnelle des ES est susceptible d’être endommagée. Réaliser une
autre prise d’essai de 25 g et procéder comme décrit en 8.3.1.
8.3.8 Centrifuger conformément à 8.3.5.
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ISO 19020:2017(F)
8.3.9 Récupérer la totalité de la phase aqueuse neutralisée pour l’étape de concentration.
Pour récupérer une quantité maximale de toxines, à la fin des étapes d’acidification et de neutralisation,
rincer l’électrode et le bécher avec quelques gouttes d’eau (5.1).
En cas d’échantillons à très forte teneur en matière grasse, l’électrode du pH-mètre peut être nettoyée
en utilisant de l’éthanol à 70 % (5.6) pour dissoudre les particules de matière grasse une fois l’analyse
terminée.
8.3.10 Autre mode opératoire d’extraction (facultatif).
Ce mode opératoire alternatif ne peut être utilisé que dans certains cas limités, tels qu’une suspicion
d’intoxication alimentaire, et il ne peut pas être utilisé pour les aliments contenant du lait ou des
produits laitiers. Cet autre mode opératoire diffère du mode opératoire décrit ci-dessous par l’absence
de l’étape de concentration par dialyse.
— Prélever le volume nécessaire (selon la trousse utilisée) de la phase aqueuse neutralisée obtenue à
l’étape 8.3.9 et procéder à l’étape de détection 8.7. Conserver la phase aqueuse neutralisée restante
à 3 °C ± 2 °C ou 5 °C ± 3 °C.
— Si un résultat négatif est obtenu, il est nécessaire de procéder à l’étape de concentration, le même
jour, comme décrit en 8.4, avec la phase aqueuse neutralisée restante.
Si ce mode opératoire n’est pas strictement respecté, il convient d’analyser une nouvelle prise d’essai.
8.4 Concentration de l’extrait (obligatoire pour le lait et les produits laitiers)
8.4.1 Pour chaque échantillon, utiliser la solution de PEG préparée conformément à 5.5.
8.4.2 Découper un morceau d’une membrane de dialyse (6.7) avec une longueur suffisante pour
contenir l’extrait entier.
8.4.3 Tremper la membrane dans l’eau (5.1) pour la réhydrater, en respectant les instructions du
fabricant (par exemple, au moins pendant 30 min à température ambiante).
Avant utilisation, rincer la membrane (parties interne et externe) avec de l’eau (5.1).
8.4.4 Verrouiller une extrémité de la membrane avec une pince de fermeture (6.8).
8.4.5 Verser la totalité de la phase aqueuse neutralisée (8.3.9) dans la membrane préparée en utilisant
un entonnoir et un petit morceau de matériau filtrant (6.9) pour éliminer les particules en suspension.
Verrouiller l’autre extrémité de la membrane avec une seconde pince de fermeture (6.8).
8.4.6 Déposer la membrane de dialyse remplie dans un plateau (6.10) rempli de solution de PEG (5.5).
8.4.7 Laisser l’extrait se concentrer pendant une nuit à 3 °C ± 2 °C ou 5 °C ± 3 °C (6.11). Si l’extrait
n’est pas suffisamment concentré (c’est-à-dire il reste plus de 5 ml dans la membrane de dialyse), le
laisser dans la solution de PEG plus longtemps (jusqu’à 3 jours) ou ajouter de la poudre de PEG sur la
membrane.
8.5 Récupération de l’extrait concentré
8.5.1 Sortir la membrane de dialyse de la solution de PEG et rincer les parties externes de la membrane
avec de l’eau (5.1) pour éliminer toute trace de solution de PEG.
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8.5.2 Ouvrir une extrémité de la membrane et récupérer l’extrait concentré; rincer soigneusement la
partie interne de la membrane de dialyse en utilisant:
— du PBS (5.4) dans le cas du lait et des produits laitiers; ou
— de l’eau (5.1) dans le cas des autres matrices.
Rincer soigneusement les parois internes de la membrane de dialyse pour obtenir une masse finale
d’extrait concentré comprise entre 5,0 g et 5,5 g (maximum 5,8 g pour les extraits visqueux).
Transférer soigneusement l’extrait concentré dans un flacon en verre ou en polypropylène (6.12).
Lors de cette étape critique, pour récupérer la quantité maximale d’entérotoxines, il est recommandé:
— de bien frotter les parois internes de la membrane de dialyse l’une contre l’autre afin d’éliminer et
de récupérer le maximum d’ES; et
— d’effectuer la récupération de l’extrait en utilisant de manière répétée de petites quantités
de PBS (5.4) ou d’eau (5.1) dans la membrane (par exemple, ajouter 1 ml ou 2 ml), en frottant
la membrane comme décrit ci-dessus et en vidant l’extrait ainsi récupéré dans le flacon, pour
maximiser la quantité d’ES récupérée. Répéter ces étapes jusqu’à obtenir une masse finale de 5,0 g
à 5,5 (5,8) g pour 25 g de prise d’essai.
En cas de toxi-infection alimentaire à staphylocoques, la masse de l’échantillon analysé peut être
inférieure à 25 g (8.2). La masse finale de l’extrait concentré (8.5.2) sera ajustée pour obtenir un rapport
de 1 à 5 entre la masse d’extrait concentré et la masse de la prise d’essai.
8.6 Conservation et étapes à suivre avant la détection
Si l’extrait concentré (8.5.2) doit être analysé dans les 48 h, le conserver à 3 °C ± 2 °C ou 5 °C ± 3 °C
(6.11). Si la détection ne peut pas avoir lieu dans les 48 h, conserver l’extrait à ≤ −18 °C (6.11), sauf
indication contraire du fabricant de la trousse de détection utilisée.
En cas d’extrait congelé, le décongeler totalement et l’homogénéiser au moyen d’un vortex avant de
réaliser l’étape de détection.
Si de la mousse apparaît, veiller à effectuer le pipetage dans la phase liquide.
8.7 Détection
Sélectionner une trousse de détection satisfaisant aux critères de performance (sensibilité, spécificité,
LOD ) pour l’ensemble du mode opératoire définie dans le présent document (voir 8.8).
50
Suivre attentivement les instructions du fabricant de la trousse utilisée pour l’étape de détection.
8.8 Critères de performance
Les critères de performance incluant la spécificité (SP, 3.2), la sensibilité (SE, 3.3), le niveau de détection
relatif 50 % (LOD , 3.4), ont été définis pour l’ensemble du mode opératoire, y compris les étapes
50
d’extraction et de détection. Le calcul du LOD a été effectué à l’aide d’un programme dédié disponible
50
sur le site Web de l’ISO.
Les critères de performance devant être atteints par les trousses commerciales sont définis comme suit:
— il convient que la SP et la SE soient supérieures à 90 %;
— il convient que la LOD soit inférieure à 0,06 ng d’ES/g. Cette valeur a été déterminée en tenant
50
compte d’une BMD estimée de 6,1 ng pour la SEA et d’une quantité d’aliment ingéré de 100 g.
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ISO 19020:2017(F)
Les données consolidées n’étant disponibles que pour la SEA, l’ES la plus fréquemment responsable des
toxi-infections alimentaires à staphylocoques, il a été décidé d’utiliser cette valeur également pour les
[4]
autres types de toxines SEB à SEE .
Les valeurs obtenues par les différentes trousses de détection et matrices alimentaires, avec et sans
l’étape de dialyse-concentration (DC) sont présentées à l’Article 12. Les laboratoires doivent se référer aux
données obtenues pour sélectionner la trousse de détection qui répond aux critères mentionnés ci-dessus.
Les données sont résumées dans les Annexes A et B pour les études interlaboratoires organisées
respectivement en 2013 et 2014. Les valeurs issues des études interlaboratoires peuvent ne pas être
...
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