ISO 16140-6:2019
(Main)Microbiology of the food chain — Method validation — Part 6: Protocol for the validation of alternative (proprietary) methods for microbiological confirmation and typing procedures
Microbiology of the food chain — Method validation — Part 6: Protocol for the validation of alternative (proprietary) methods for microbiological confirmation and typing procedures
This document specifies the general principle and the technical protocol for the validation of alternative confirmation methods for microbiology in the food chain. This document compares the result of the alternative confirmation method against the confirmation procedure of a reference method or, if needed, a reference confirmation method (e.g. whole genome sequencing). This document is applicable to the validation of alternative confirmation methods used for the analysis (detection or quantification) of isolated microorganisms in: — products intended for human consumption; — products intended for animal feeding; — environmental samples in the area of food and feed production, handling; — samples from the primary production stage. Validated alternative confirmation methods can be used to replace (partly or completely) the confirmation procedure described in: — the reference method; — an alternative method validated in accordance with ISO 16140-2 only if one of the isolation agars specified in the validation study of the alternative confirmation method is used. This document is also applicable to the validation of alternative typing methods, where the reference method can be, for example, a serological method (e.g. serotyping of Salmonella) or a molecular method (e.g. typing of Shiga toxin-producing E. coli). This document is, in particular, applicable to bacteria and fungi. Some clauses can be applicable to other (micro)organisms, to be determined on a case-by-case basis. Validation studies in accordance with this document are primarily intended to be performed by organizations or expert laboratories involved in method validation, but can also be used by a single laboratory, especially when performing in-house validation under certain conditions (see ISO 16140-4).
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des méthodes — Partie 6: Protocole pour la validation de méthodes alternatives (commerciales) pour la confirmation microbiologique et le typage
Le présent document établit le principe général ainsi que le protocole technique pour la validation des méthodes alternatives de confirmation dans le domaine de la microbiologie de la chaîne alimentaire. Le présent document compare le résultat de la méthode alternative de confirmation avec celui du mode opératoire de confirmation d'une méthode de référence ou, si nécessaire, d'une méthode de confirmation de référence (par exemple, séquençage de génome complet). Le présent document est applicable à la validation de méthodes alternatives de confirmation utilisées pour l'analyse (recherche ou quantification) de micro-organismes isolés présents dans: — les produits destinés à la consommation humaine; — les produits destinés à l'alimentation animale; — les échantillons environnementaux dans les domaines de la production et de la manutention de produits alimentaires; — les échantillons au stade de la production primaire. Des méthodes alternatives de confirmation validées peuvent être utilisées pour remplacer (en partie ou en totalité) le mode opératoire de confirmation décrit dans: — la méthode de référence; — une méthode alternative validée conformément à l'ISO 16140‑2 uniquement si l'une des géloses d'isolement spécifiées dans l'étude de validation de la méthode de confirmation alternative est utilisée. Le présent document est également applicable à la validation de méthodes alternatives de typages, dans lesquelles la méthode de référence peut, par exemple, être une méthode sérologique (par exemple, sérotypage de Salmonella) ou une méthode moléculaire (par exemple, typage d'E. coli produisant des shigatoxines). Le présent document est notamment applicable aux bactéries et aux champignons. Certains articles peuvent être applicables à d'autres (micro)organismes, qui doivent être déterminés au cas par cas. Les études de validation conformément au présent document sont principalement destinées à être effectuées par des organismes ou des laboratoires experts impliqués dans la validation des méthodes, mais peuvent également être utilisées par un seul laboratoire, notamment lors de la réalisation d'une validation interne sous certaines conditions (voir ISO 16140‑4).
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Standards Content (Sample)
INTERNATIONAL ISO
STANDARD 16140-6
First edition
2019-11
Microbiology of the food chain —
Method validation —
Part 6:
Protocol for the validation of
alternative (proprietary) methods
for microbiological confirmation and
typing procedures
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des méthodes —
Partie 6: Protocole pour la validation de méthodes alternatives
(commerciales) pour la confirmation microbiologique et le typage
Reference number
ISO 16140-6:2019(E)
©
ISO 2019
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ISO 16140-6:2019(E)
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be reproduced or utilized otherwise in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, or posting
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Published in Switzerland
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ISO 16140-6:2019(E)
Contents Page
Foreword .iv
Introduction .v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 2
4 General principles for the validation of confirmation and typing methods.3
5 Strains . 4
6 Method comparison study . 4
6.1 General . 4
6.2 Selection of test strains . 4
6.3 Inclusivity study . 4
6.3.1 Testing of target strains . 4
6.3.2 Family level (non-Salmonella) . 5
6.3.3 Genus level (non-Salmonella) . 5
6.3.4 Species level (non-Salmonella) . 5
6.3.5 Microbial (sub)type level (non-Salmonella) . 5
6.3.6 Salmonella genus or species level . 5
6.3.7 Salmonella serovar level . 6
6.4 Exclusivity study . 6
6.4.1 Testing of non-target strains . 6
6.4.2 Family level (non-Salmonella) . 6
6.4.3 Genus level (non-Salmonella) . 6
6.4.4 Species level (non-Salmonella) . 6
6.4.5 Microbial (sub)type level (non-Salmonella) . 6
6.4.6 Salmonella genus or species level . 7
6.4.7 Salmonella serovar level . 7
6.5 Expression and interpretation of results . 7
6.6 Evaluation . 9
7 Interlaboratory study .10
7.1 General .10
7.2 Data sets to be obtained .10
7.3 Protocol .11
7.4 Expression of results .12
7.5 Interpretation and evaluation .12
Annex A (normative) Points to be considered when selecting strains for testing inclusivity
and exclusivity .14
Annex B (informative) Example of the validation of an alternative confirmation method to
the species level (Listeria monocytogenes) .16
Annex C (informative) Example of the validation of an alternative typing method to the
Salmonella serovar level (15 different serovars claimed) .19
Annex D (normative) Overview of the various options for validation under this document
and the acceptability limits .23
Bibliography .25
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ISO 16140-6:2019(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out
through ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical
committee has been established has the right to be represented on that committee. International
organizations, governmental and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work.
ISO collaborates closely with the International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of
electrotechnical standardization.
The procedures used to develop this document and those intended for its further maintenance are
described in the ISO/IEC Directives, Part 1. In particular, the different approval criteria needed for the
different types of ISO documents should be noted. This document was drafted in accordance with the
editorial rules of the ISO/IEC Directives, Part 2 (see www .iso .org/ directives).
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of
patent rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. Details of
any patent rights identified during the development of the document will be in the Introduction and/or
on the ISO list of patent declarations received (see www .iso .org/ patents).
Any trade name used in this document is information given for the convenience of users and does not
constitute an endorsement.
For an explanation of the voluntary nature of standards, the meaning of ISO specific terms and
expressions related to conformity assessment, as well as information about ISO’s adherence to the
World Trade Organization (WTO) principles in the Technical Barriers to Trade (TBT) see www .iso .org/
iso/ foreword .html.
This document was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9,
Microbiology.
A list of all parts of the ISO 16140 series can be found on the ISO website.
Any feedback or questions on this document should be directed to the user’s national standards body. A
complete listing of these bodies can be found at www .iso .org/ members .html.
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ISO 16140-6:2019(E)
Introduction
0.1 The ISO 16140 series
The ISO 16140 series has been expanded in response to the need for various ways to validate or verify
test methods. It is the successor to ISO 16140:2003. The ISO 16140 series consists of six parts with the
general title, Microbiology of the food chain — Method validation:
— Part 1: Vocabulary;
— Part 2: Protocol for the validation of alternative (proprietary) methods against a reference method;
— Part 3: Protocol for the verification of validated reference methods and validated alternative methods
in a single laboratory;
— Part 4: Protocol for method validation in a single laboratory;
— Part 5: Protocol for factorial interlaboratory validation for non-proprietary methods;
— Part 6: Protocol for the validation of alternative (proprietary) methods for microbiological confirmation
and typing procedures.
ISO 17468 is a closely linked International Standard, which establishes technical rules for the
development and validation of standardized methods.
In general, two stages are needed before a method can be used in a laboratory.
— The first stage is the validation of the method. Validation is conducted using a study in a single
laboratory followed by an interlaboratory study (see ISO 16140-2, ISO 16140-5 and as described in
this document). In the case when a method is validated within one laboratory (see ISO 16140-4), no
interlaboratory study is conducted.
— The second stage is method verification, where a laboratory demonstrates that it can satisfactorily
perform a validated method. This is described in ISO 16140-3. Verification is only applicable to
methods that have been validated using an interlaboratory study.
In general, two types of methods are distinguished: reference methods and alternative methods.
A reference method is defined in ISO 16140-1:2016, 2.59, as an “internationally recognized and widely
accepted method”. The note to entry clarifies that “these are ISO standards and standards jointly
published by ISO and CEN or other regional/national standards of equivalent standing”.
In the ISO 16140 series, reference methods include standardized reference (ISO and CEN) methods as
defined in ISO 17468:2016, 3.5, as a “reference method described in a standard”.
An alternative method (method submitted for validation) is defined in ISO 16140-1:2016, 2.4, as a
“method of analysis that detects or quantifies, for a given category of products, the same analyte as
is detected or quantified using the corresponding reference method”. The note to entry clarifies that:
“The method can be proprietary. The term ‘alternative’ is used to refer to the entire ‘test procedure
and reaction system’. This term includes all ingredients, whether material or otherwise, required for
implementing the method.”.
ISO 16140-4 addresses validation within a single laboratory. The results are therefore only valid for
the laboratory that conducted the study. In this case, verification (as described in ISO 16140-3) is not
applicable. ISO 16140-5 describes protocols for non-proprietary methods where a more rapid validation
is required or when the method to be validated is highly specialized and the number of participating
laboratories required by ISO 16140-2 cannot be reached. ISO 16140-4 and ISO 16140-5 can be used
for validation against a reference method. ISO 16140-4 (qualitative and quantitative) and ISO 16140-5
(quantitative only) can also be used for validation without a reference method.
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ISO 16140-6:2019(E)
The flow chart in Figure 1 gives an overview of the links between the different parts mentioned above.
It also guides the user in selecting the right part of the ISO 16140 series, taking into account the purpose
of the study and the remarks given above.
Figure 1 — Flow chart for application of the ISO 16140 series
NOTE In this document, the words “category”, “type” and/or “item” are sometimes combined with “(food)”
to improve readability. However, the word “food” is interchangeable with “feed” and other areas of the food chain
as mentioned in Clause 1.
This document, ISO 16140-6, is somewhat different from the other parts in the ISO 16140 series in that it
relates to a very specific situation where only the confirmation procedure of a method is to be validated
[e.g. the biochemical confirmation of Enterobacteriaceae (see ISO 21528-2)]. The confirmation procedure
advances a suspected (presumptive) result to a confirmed positive result. The validation of alternative
typing techniques (e.g. serotyping of Salmonella) is also covered by this document. The validation study
in this document clearly defines the selective agar(s) from which strains can be confirmed using the
alternative confirmation method. If successfully validated, the alternative confirmation method can
only be used if strains are recovered on an agar that was used and shown to be acceptable within the
validation study. Figure 2 shows the possibilities where an alternative confirmation method validated
in accordance with this document can be applied (see text in the boxes).
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ISO 16140-6:2019(E)
Figure 2 — Use of validated alternative confirmation methods (described in this document)
EXAMPLE An example application of a validated alternative confirmation method is as follows.
An alternative confirmation method based on ELISA has been validated to replace the biochemical confirmation
for Salmonella as described in ISO 6579-1. In the validation study, XLD (mandatory agar in accordance with
ISO 6579-1) plus BGA and a specified chromogenic agar (two optional agars for second plating in accordance with
ISO 6579-1) were used as the agars to start the confirmation. The validated confirmation method can be used to
replace the biochemical confirmation under the following conditions:
— by laboratories using the ISO 6579-1; or
— by laboratories using an ISO 16140-2 validated alternative method that refers to ISO 6579-1 for confirmation; or
— by laboratories using an ISO 16140-2 validated alternative method that starts the confirmation from XLD
and/or BGA agar and/or the specified chromogenic agar.
The validated confirmation method cannot be used under the following conditions:
— by laboratories using an ISO 16140-2 validated alternative method that refers only to agars other than those
included in the validation to start the confirmation (e.g. Hektoen agar and SS agar only); or
— by laboratories using an ISO 16140-2 validated alternative method that refers only to a confirmation
procedure that does not require isolation on agar.
0.2 Validation and verification of methods for the microbiological confirmation and typing
procedures
The procedure described in this document is intended for the “full” validation of alternative
(proprietary) methods for microbiological confirmation and/or typing, hereafter referred to as
“alternative confirmation methods”.
During the validation study, the performance of the alternative confirmation method is compared to
the performance of the reference confirmation procedure.
The procedure for verification of alternative confirmation methods in a single laboratory is described
in ISO 16140-3.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 16140-6:2019(E)
Microbiology of the food chain — Method validation —
Part 6:
Protocol for the validation of alternative (proprietary)
methods for microbiological confirmation and typing
procedures
1 Scope
This document specifies the general principle and the technical protocol for the validation of alternative
confirmation methods for microbiology in the food chain. This document compares the result of the
alternative confirmation method against the confirmation procedure of a reference method or, if
needed, a reference confirmation method (e.g. whole genome sequencing).
This document is applicable to the validation of alternative confirmation methods used for the analysis
(detection or quantification) of isolated microorganisms in:
— products intended for human consumption;
— products intended for animal feeding;
— environmental samples in the area of food and feed production, handling;
— samples from the primary production stage.
Validated alternative confirmation methods can be used to replace (partly or completely) the
confirmation procedure described in:
— the reference method;
— an alternative method validated in accordance with ISO 16140-2 only if one of the isolation agars
specified in the validation study of the alternative confirmation method is used.
This document is also applicable to the validation of alternative typing methods, where the reference
method can be, for example, a serological method (e.g. serotyping of Salmonella) or a molecular method
(e.g. typing of Shiga toxin-producing E. coli).
This document is, in particular, applicable to bacteria and fungi. Some clauses can be applicable to other
(micro)organisms, to be determined on a case-by-case basis.
Validation studies in accordance with this document are primarily intended to be performed by
organizations or expert laboratories involved in method validation, but can also be used by a single
laboratory, especially when performing in-house validation under certain conditions (see ISO 16140-4).
2 Normative references
The following documents are referred to in the text in such a way that some or all of their content
constitutes requirements of this document. For dated references, only the edition cited applies. For
undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 16140-1:2016, Microbiology of the food chain — Method validation — Part 1: Vocabulary
© ISO 2019 – All rights reserved 1
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ISO 16140-6:2019(E)
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the terms and definitions given in ISO 16140-1 and the following apply.
ISO and IEC maintain terminological databases for use in standardization at the following addresses:
— ISO Online browsing platform: available at https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: available at http:// www .electropedia .org/
3.1
acceptability limit
AL
maximum positive or negative acceptable difference between the reference value (or if not known, the
accepted reference value) of a sample and an individual result obtained when applying the operating
procedure of an analytical method
Note 1 to entry: Annex D provides further information on the use of AL for this document.
[SOURCE: ISO 16140-1:2016, 2.1, modified — Note 1 to entry has been replaced.]
3.2
alternative confirmation or typing method
confirmation or typing method submitted for validation
method of analysis that confirms or types the same analyte as is confirmed or typed using the
corresponding reference method
Note 1 to entry: The method can be proprietary. The term “alternative” is used to refer to the entire “test
procedure and reaction system”. This term includes all ingredients, whether material or otherwise, required for
implementing the method.
Note 2 to entry: For clarity of reading, the text in this document generally describes validation of a confirmation
method (detailed examples are given in Annex B). If applicable, this can be read as validation of a typing method
(detailed examples are given in Annex C).
3.3
confirmation procedure
number of defined confirmation tests (3.4) that are performed on a strain, the combined results of which
are used to definitively confirm the identity of that strain
3.4
confirmation test
single test which is carried out to verify a presumptive result
Note 1 to entry: The result of a single test may not on its own be able to definitively confirm the identity of the strain.
[SOURCE: ISO 16140-1:2016, 2.17, modified — In the term and definition, “procedure or” has been
removed, “single” has been added and the Note 1 to entry has been replaced.]
3.5
microbial (sub)type
group of closely related microorganisms (within a species) distinguished by their shared specific
characteristics as determined by, for example, serological testing (serotype) or molecular testing
(genotype)
3.6
non-target strain
strain, defined according to the scope of the reference method, that would not reasonably be expected
to be confirmed by the alternative method
[SOURCE: ISO 16140-1:2016, 2.44, modified — In the definition, “confirmed” has replaced “detected or
enumerated”.]
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ISO 16140-6:2019(E)
3.7
reference confirmation or typing procedure
combination of the confirmation or typing tests that are claimed to be replaced by the alternative
confirmation or typing method (3.2)
Note 1 to entry: The number of confirmation tests (3.4) depends on the reference method for the specific
microorganisms. The number of confirmation tests can also be one.
3.8
target strain
strain, defined according to the scope of the reference method, that is expected to be confirmed by the
alternative method
[SOURCE: ISO 16140-1:2016, 2.74, modified — In the definition, “confirmed” has replaced “detected or
enumerated”.]
3.9
typing procedure
process of determining a particular microbial (sub)type (3.5)
4 General principles for the validation of confirmation and typing methods
In the validation study, the alternative confirmation method is compared to the confirmation
procedure described in the reference method for the enumeration or detection of specific (groups of)
microorganisms.
The validation protocol comprises two phases:
— a method comparison study, of the alternative confirmation method against the reference
confirmation procedure, carried out in the organizing laboratory;
— an interlaboratory study.
NOTE It is possible, if relevant, to include inclusivity or exclusivity data obtained in an ISO 16140-2 validation
study into a study related to this document.
The validation protocol shall clearly define the selective agar(s) from which strains can be confirmed
using the alternative confirmation method. All inclusivity and exclusivity strains shall be tested. In
cases where some strains are unable to grow on the specified selective agar(s), a non-selective agar
plate shall also be included in the method comparison study and the interlaboratory study.
The technical rules for performing the method comparison study and the interlaboratory study
are given in Clauses 6 and 7. The following six cases are covered; a distinction is made between the
confirmation/typing of Salmonella and that of other microorganisms:
— validation of methods used for confirmation to the family level (non-Salmonella);
— validation of methods used for confirmation to the genus level (non-Salmonella);
— validation of methods used for confirmation to the species level (non-Salmonella);
— validation of methods used for confirmation/typing to the microbial (sub)type level (non-Salmonella);
— validation of methods used for confirmation/typing to the Salmonella genus or species level;
— validation of methods used for confirmation/typing to the Salmonella serovar level.
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ISO 16140-6:2019(E)
5 Strains
The pure strains used for determining the inclusivity and the exclusivity shall be well-characterized
in line with the purpose of the validation study. The identification information of each strain will be
used to (additionally) confirm the result in cases of discrepancies between the results of the reference
confirmation procedure and the alternative confirmation method.
NOTE National, regional or international reference laboratories could be contacted during such
investigations.
6 Method comparison study
6.1 General
The method comparison study is the part of the validation that is performed in one laboratory.
It consists of an inclusivity and exclusivity study of the alternative confirmation method. The results
are then compared to those of the reference confirmation procedure.
6.2 Selection of test strains
A range of strains shall be used. Criteria for selecting test strains are given in Annex A. The strains
selected should take into account the measurement principle (e.g. culture-based, immunological,
molecular-based) of the alternative method. Different measurement principles may require the use
of panels of different test strains, representing the diversity of the studied microorganism(s). It is
important to include non-target microorganisms that may grow on the media used for the reference and
for the alternative method, including those that produce suspect colonies (i.e. look like those produced
by the target strains).
The rationale for the choice of the strains and their characteristics shall be included in the validation
study report.
Each strain shall be characterized biochemically and/or serologically and/or genetically in sufficient
detail for its identity to be known. Strains should preferably have been isolated from foods, feed, the
food-processing environment or from primary production; depending on the scope of the validation.
However, clinical, environmental and culture collection strains can also be used. The original source
of all strains should be known, and they should be held in a local (e.g. expert laboratory), national or
international culture collection to enable them to be used in future testing if required. See ISO 11133
for guidance on the local maintenance of stock cultures.
Results generated by a specialized reference laboratory, using the reference method, can be used if
the laboratory performing the validation study is not able to perform the confirmation/typing of rare
strains according to the reference method. For example, the use of serotyping results of a Salmonella
reference laboratory is allowed in cases of rare Salmonella serovars.
6.3 Inclusivity study
6.3.1 Testing of target strains
Pure cultures of all target strains shall be tested with both the reference confirmation procedure and
the alternative confirmation method. It is not necessary to repeat the reference confirmation procedure
along with the alternative
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 16140-6
Première édition
2019-11
Microbiologie de la chaîne
alimentaire — Validation des
méthodes —
Partie 6:
Protocole pour la validation de
méthodes alternatives (commerciales)
pour la confirmation microbiologique
et le typage
Microbiology of the food chain — Method validation —
Part 6: Protocol for the validation of alternative (proprietary)
methods for microbiological confirmation and typing procedures
Numéro de référence
ISO 16140-6:2019(F)
©
ISO 2019
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ISO 16140-6:2019(F)
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Publié en Suisse
ii © ISO 2019 – Tous droits réservés
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ISO 16140-6:2019(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 2
3 Termes et définitions . 2
4 Principes généraux applicables à la validation de méthodes de confirmation et de typage 3
5 Souches . 4
6 Étude comparative des méthodes . 4
6.1 Généralités . 4
6.2 Sélection des souches d’essai . 4
6.3 Étude d’inclusivité . 5
6.3.1 Essais de souches cibles . 5
6.3.2 Au niveau de la famille (non-Salmonella) . 5
6.3.3 Au niveau du genre (non-Salmonella) . 5
6.3.4 Au niveau de l’espèce (non-Salmonella) . 5
6.3.5 Au niveau du (sous)type microbien (non-Salmonella) . 5
6.3.6 Au niveau de l’espèce ou du genre Salmonella . 6
6.3.7 Au niveau du sérotype de Salmonella . 6
6.4 Étude d’exclusivité . 6
6.4.1 Essais de souches non cibles . 6
6.4.2 Au niveau de la famille (non-Salmonella) . 7
6.4.3 Au niveau du genre (non-Salmonella) . 7
6.4.4 Au niveau de l’espèce (non-Salmonella) . 7
6.4.5 Au niveau du (sous)type microbien (non-Salmonella) . 7
6.4.6 Au niveau de l’espèce ou du genre Salmonella . 7
6.4.7 Au niveau du sérotype de Salmonella . 8
6.5 Expression et interprétation des résultats . 8
6.6 Évaluation .10
7 Étude interlaboratoires .11
7.1 Généralités .11
7.2 Ensembles de données à obtenir.11
7.3 Protocole .12
7.4 Expression des résultats .13
7.5 Interprétation et évaluation .13
Annexe A (normative) Aspects à prendre en compte lors du choix des souches pour
les études d’inclusivité et d’exclusivité .15
Annexe B (informative) Exemple de méthode alternative de confirmation au niveau
de l’espèce (Listeria monocytogenes) .17
Annexe C (informative) Exemple de validation d’une méthode alternative de typage
au niveau du sérotype de Salmonella (15 sérotypes différents revendiqués) .20
Annexe D (normative) Aperçu des différentes options de validation conformément
au présent document et des limites d’acceptabilité .24
Bibliographie .26
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ISO 16140-6:2019(F)
Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier, de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www
.iso .org/ directives).
L’attention est attirée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www .iso .org/ brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité, à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la nature volontaire des normes, la signification des termes et expressions
spécifiques de l’ISO liés à l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion
de l’ISO aux principes de l’Organisation mondiale du commerce (OMC) concernant les obstacles
techniques au commerce (OTC), voir www .iso .org/ avant -propos.
Le présent document a été élaboré par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-
comité SC 9, Microbiologie.
Une liste de toutes les parties de la série ISO 16140 se trouve sur le site web de l’ISO.
Il convient que l’utilisateur adresse tout retour d’information ou toute question concernant le présent
document à l’organisme national de normalisation de son pays. Une liste exhaustive desdits organismes
se trouve à l’adresse www .iso .org/ fr/ members .html.
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ISO 16140-6:2019(F)
Introduction
0.1 Série ISO 16140
La série ISO 16140 a été étendue en réponse à la nécessité de disposer de différents protocoles pour la
validation ou la vérification des méthodes d’essai. Elle succède à l’ISO 16140:2003. La série ISO 16140
comprend six parties ayant le titre général Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des
méthodes:
— Partie 1: Vocabulaire;
— Partie 2: Protocole pour la validation de méthodes alternatives (commerciales) par rapport à une
méthode de référence;
— Partie 3: Protocole pour la vérification de méthodes alternatives validées et de référence appliquées
dans un laboratoire;
— Partie 4: Protocole pour la validation de méthodes dans un seul laboratoire;
— Partie 5: Protocole pour la validation interlaboratoires de méthodes non commerciales par plan
factoriel;
— Partie 6: Protocole pour la validation de méthodes alternatives (commerciales) pour la confirmation
microbiologique et le typage.
L’ISO 17468 est une Norme internationale étroitement liée, qui établit les règles techniques pour le
développement et la validation de méthodes normalisées.
En général, deux étapes sont nécessaires avant de pouvoir utiliser une méthode en laboratoire.
— La première étape est la validation de la méthode. Celle-ci est effectuée à l’aide d’une étude dans un
seul laboratoire suivie d’une étude interlaboratoires (voir l’ISO 16140-2, l’ISO 16140-5 et le présent
document). Dans le cas où une méthode est validée dans un seul laboratoire (voir l’ISO 16140-4),
aucune étude interlaboratoires n’est effectuée.
— La deuxième étape est la vérification des méthodes, au cours de laquelle un laboratoire prouve qu’il
peut effectuer une méthode validée de manière satisfaisante. Celle-ci est décrite dans l’ISO 16140-3.
La vérification n’est applicable qu’aux méthodes qui ont été validées à l’aide d’une étude
interlaboratoires.
On distingue en général deux types de méthodes: les méthodes de référence et les méthodes alternatives.
Une méthode de référence est définie dans l’ISO 16140-1:2016, 2.59, comme étant une «méthode
reconnue internationalement et largement acceptée». La note à l’article clarifie que «ces normes sont
des normes ISO et des normes publiées conjointement par l’ISO et le CEN ou d’autres normes régionales/
nationales de niveau équivalent».
Dans la série ISO 16140, les méthodes de référence comprennent les méthodes de référence normalisées
(ISO et CEN) telle que définie dans l’ISO 17468:2016, 3.5, en tant que «méthode de référence décrite
dans une norme».
Une méthode alternative (une méthode soumise à validation) est définie dans l’ISO 16140-1:2016, 2.4,
en tant que «méthode d’analyse permettant de détecter ou de quantifier, pour une catégorie de produits
donnée, le même analyte que celui détecté ou quantifié avec la méthode de référence correspondante».
La note à l’article clarifie que: «La méthode peut être commerciale. L’adjectif «alternatif» se réfère à la
totalité du «mode opératoire d’analyse et du système réactionnel». Ce terme recouvre tous les éléments
nécessaires à la mise en œuvre de la méthode, qu’ils soient matériels ou autres.»
L’ISO 16140-4 traite de la validation dans un seul laboratoire. Par conséquent, les résultats sont
uniquement valides pour le laboratoire effectuant l’étude. Dans ce cas, aucune vérification (comme décrit
dans l’ISO 16140-3) n’est applicable. L’ISO 16140-5 décrit les protocoles applicables aux méthodes non
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ISO 16140-6:2019(F)
commerciales dans lesquelles une validation plus rapide est nécessaire ou dans lesquelles la méthode
à valider est hautement spécialisée, et le nombre de laboratoires participants requis par l’ISO 16140-2
ne peut pas être atteint. L’ISO 16140-4 et l’ISO 16140-5 peuvent être utilisées pour la validation avec
méthode de référence. L’ISO 16140-4 (qualitatif et quantitatif) et l’ISO 16140-5 (uniquement quantitatif)
peuvent également être utilisées pour la validation sans méthode de référence.
Le logigramme de la Figure 1 donne un aperçu des relations entre les différentes parties susmentionnées.
Il aide également l’utilisateur à choisir la partie appropriée de la série ISO 16140, en tenant compte de
l’objectif de l’étude et des remarques énoncées ci-dessus.
Figure 1 — Logigramme relatif à l’application de la série ISO 16140
NOTE Dans le présent document, les termes «catégorie», «type» et/ou «matrice» sont parfois associés au
terme «(aliment)» pour une meilleure compréhension. Cependant, le terme «aliment» peut être remplacé par
«aliment pour animaux» et par les autres secteurs de la chaîne alimentaire tels que mentionnés à l’Article 1.
Le présent document, ISO 16140-6, est quelque peu différent des autres parties de la série ISO 16140
car il concerne une situation très spécifique dans laquelle seul le mode opératoire de confirmation
d’une méthode doit être validé [par exemple, la confirmation biochimique des Enterobacteriaceae
(voir ISO 21528-2)]. Le mode opératoire de confirmation modifie un résultat suspecté (présomptif)
en un résultat positif confirmé. La validation de méthodes alternatives de typage (par exemple,
sérotypage de Salmonella) est également couverte par le présent document. L’étude de validation du
présent document définit clairement la/les gélose(s) sélective(s) à partir de laquelle/desquelles les
souches peuvent être confirmées à l’aide de la méthode alternative de confirmation. Lorsque la méthode
alternative de confirmation est validée, elle ne peut être appliquée que si les souches sont cultivées sur
une gélose utilisée et jugée acceptable lors de l’étude de validation. La Figure 2 illustre les situations
dans lesquelles une méthode alternative de confirmation validée conformément au présent document
peut être appliquée (voir le texte dans les cases).
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ISO 16140-6:2019(F)
Figure 2 — Utilisation de méthodes alternatives de confirmation
(décrites dans le présent document)
EXEMPLE Un exemple d’application d’une méthode alternative de confirmation validée est donné ci-après.
Une méthode alternative de confirmation fondée sur un ELISA a été validée pour remplacer la confirmation
biochimique de Salmonella tel qu’il est décrit dans l’ISO 6579-1. Lors de l’étude de validation, la gélose XLD (gélose
obligatoire conformément à l’ISO 6579-1) ainsi que la gélose BGA et une gélose chromogène spécifiée (deux géloses
facultatives pour le deuxième ensemencement conformément à l’ISO 6579-1) ont été utilisées pour commencer la
confirmation. La méthode de confirmation validée peut être utilisée pour remplacer la confirmation biochimique
dans les conditions suivantes:
— par des laboratoires utilisant l’ISO 6579-1; ou
— par des laboratoires utilisant une méthode alternative validée selon l’ISO 16140-2 faisant référence à
l’ISO 6579-1 pour la confirmation; ou
— par des laboratoires utilisant une méthode alternative validée selon l’ISO 16140-2 qui commence la
confirmation à partir de la gélose XLD et/ou la gélose BGA et/ou la gélose chromogène spécifiée.
La méthode de confirmation validée ne peut pas être utilisée dans les conditions suivantes:
— par des laboratoires utilisant une méthode alternative validée selon l’ISO 16140-2 faisant uniquement
référence à des géloses autres que celles incluses dans la validation pour commencer la confirmation (par
exemple, la gélose Hektoen et la gélose SS uniquement); ou
— par des laboratoires utilisant une méthode alternative validée selon l’ISO 16140-2 faisant uniquement
référence à un mode opératoire de confirmation ne nécessitant pas d’isolement sur gélose.
0.2 Validation et vérification des méthodes pour les modes opératoires de confirmation
microbiologique et typage
Le mode opératoire décrit dans le présent document est destiné à la validation «complète» de méthodes
alternatives (commerciales) pour la confirmation microbiologique et/ou le typage, ci-après appelées
«méthodes alternatives de confirmation».
Pendant l’étude de validation, la performance de la méthode alternative de confirmation est comparée
avec celle du mode opératoire de confirmation de référence.
Le mode opératoire de vérification des méthodes alternatives de confirmation dans un seul laboratoire
est décrit dans l’ISO 16140-3.
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NORME INTERNATIONALE ISO 16140-6:2019(F)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des
méthodes —
Partie 6:
Protocole pour la validation de méthodes alternatives
(commerciales) pour la confirmation microbiologique et
le typage
1 Domaine d’application
Le présent document établit le principe général ainsi que le protocole technique pour la validation des
méthodes alternatives de confirmation dans le domaine de la microbiologie de la chaîne alimentaire.
Le présent document compare le résultat de la méthode alternative de confirmation avec celui du
mode opératoire de confirmation d’une méthode de référence ou, si nécessaire, d’une méthode de
confirmation de référence (par exemple, séquençage de génome complet).
Le présent document est applicable à la validation de méthodes alternatives de confirmation utilisées
pour l’analyse (recherche ou quantification) de micro-organismes isolés présents dans:
— les produits destinés à la consommation humaine;
— les produits destinés à l’alimentation animale;
— les échantillons environnementaux dans les domaines de la production et de la manutention de
produits alimentaires;
— les échantillons au stade de la production primaire.
Des méthodes alternatives de confirmation validées peuvent être utilisées pour remplacer (en partie ou
en totalité) le mode opératoire de confirmation décrit dans:
— la méthode de référence;
— une méthode alternative validée conformément à l’ISO 16140-2 uniquement si l’une des géloses
d’isolement spécifiées dans l’étude de validation de la méthode de confirmation alternative est
utilisée.
Le présent document est également applicable à la validation de méthodes alternatives de typages,
dans lesquelles la méthode de référence peut, par exemple, être une méthode sérologique (par exemple,
sérotypage de Salmonella) ou une méthode moléculaire (par exemple, typage d’E. coli produisant des
shigatoxines).
Le présent document est notamment applicable aux bactéries et aux champignons. Certains articles
peuvent être applicables à d’autres (micro)organismes, qui doivent être déterminés au cas par cas.
Les études de validation conformément au présent document sont principalement destinées à être
effectuées par des organismes ou des laboratoires experts impliqués dans la validation des méthodes,
mais peuvent également être utilisées par un seul laboratoire, notamment lors de la réalisation d’une
validation interne sous certaines conditions (voir ISO 16140-4).
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ISO 16140-6:2019(F)
2 Références normatives
Les documents suivants sont cités dans le texte de sorte qu’ils constituent, pour tout ou partie de leur
contenu, des exigences du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique.
Pour les références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les
éventuels amendements).
ISO 16140-1:2016, Microbiologie de la chaîne alimentaire — Validation des méthodes — Partie 1:
Vocabulaire
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et les définitions de l’ISO 16140-1 ainsi que les
suivants s’appliquent.
L’ISO et l’IEC tiennent à jour des bases de données terminologiques destinées à être utilisées en
normalisation, consultables aux adresses suivantes:
— ISO Online browsing platform: disponible à l’adresse https:// www .iso .org/ obp
— IEC Electropedia: disponible à l’adresse http:// www .electropedia .org/
3.1
limite d’acceptabilité
AL
différence maximale, positive ou négative, acceptable entre la valeur de référence (ou si celle-ci n’est
pas connue, la valeur de référence acceptée) d’un échantillon et un résultat individuel obtenu suite à
l’application du mode opératoire d’une méthode d’analyse
Note 1 à l'article: L’Annexe D fournit des informations supplémentaires sur l’utilisation de la limite d’acceptabilité
(AL) pour le présent document.
[SOURCE: ISO 16140-1:2016, 2.1, modifiée — La Note 1 à l’article a été remplacée.]
3.2
méthode alternative de confirmation ou de typage
méthode de confirmation ou de typage soumise à validation
méthode d’analyse permettant de confirmer ou de typer le même analyte que celui confirmé ou typé à
l’aide de la méthode de référence correspondante
Note 1 à l'article: La méthode peut être commerciale. Le terme «alternative» se réfère à la totalité du «mode
opératoire d’analyse et du système réactionnel». Ce terme recouvre tous les éléments nécessaires à la mise en
œuvre de la méthode, qu’ils soient matériels ou autres.
Note 2 à l'article: Pour une meilleure compréhension, le texte du présent document décrit généralement la
validation d’une méthode de confirmation (des exemples détaillés sont donnés à l’Annexe B). Le cas échéant,
ceci peut être interprété comme la validation d’une méthode de typage (des exemples détaillés sont donnés
à l’Annexe C).
3.3
mode opératoire de confirmation
ensemble des essais de confirmation (3.4) définis effectués sur une souche, dont les résultats combinés
sont utilisés pour confirmer définitivement l’identité de cette souche
3.4
essai de confirmation
essai unique visant à vérifier un résultat présomptif
Note 1 à l'article: Il se peut que le résultat d’un essai unique ne permette pas de confirmer définitivement l’identité
de la souche.
2 © ISO 2019 – Tous droits réservés
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ISO 16140-6:2019(F)
[SOURCE: ISO 16140-1:2016, 2.17, modifiée — Dans le terme et la définition, «mode opératoire ou» a été
supprimé, «unique» a été ajouté et la Note 1 à l’article a été remplacée.]
3.5
(sous)type microbien
groupe de micro-organismes (d’une même espèce) étroitement apparentés qui se différencient par des
caractéristiques spécifiques communes telles que déterminées, par exemple, par des essais sérologiques
(sérotypes) ou moléculaires (génotypes)
3.6
souche non cible
souche, définie selon le domaine d’application de la méthode de référence, raisonnablement susceptible
de ne pas être confirmée par la méthode alternative
[SOURCE: ISO 16140-1:2016, 2.44, modifiée — Dans la définition, «confirmée» a remplacé «détectée ni
dénombrée».]
3.7
mode opératoire de confirmation ou de typage de référence
ensemble des essais de confirmation ou de typage déclarés remplacés par la méthode alternative de
confirmation ou de typage (3.2)
Note 1 à l'article: Le nombre d’essais de confirmation (3.4) dépend de la méthode de référence applicable aux
micro-organismes spécifiques. Le nombre d’essais de confirmation peut également être égal à un.
3.8
souche cible
souche, définie selon le domaine d’application de la méthode de référence, susceptible d’être confirmée
par la méthode alternative
[SOURCE: ISO 16140-1:2016, 2.74, modifiée — Dans la définition, «confirmée» a remplacé «détectée ou
dénombrée».]
3.9
typage
processus de détermination d’un (sous)type microbien (3.5)
4 Principes généraux applicables à la validation de méthodes de confirmation et
de typage
Au cours de l’étude de validation, la méthode alternative de confirmation est comparée avec le mode
opératoire de confirmation décrit dans la méthode de référence applicable au dénombrement ou à la
recherche de (groupes de) micro-organismes spécifiques.
Le protocole de validation comprend deux étapes:
— une étude comparative de la méthode alternative de confirmation par rapport au mode opératoire
de confirmation de référence, réalisée au sein du laboratoire organisateur;
— une étude interlaboratoires.
NOTE Si cela est pertinent, il est possible d’inclure, dans l’étude associée au présent document, les données
obtenues dans l’étude d’inclusivité ou d’exclusivité d’une validation selon l’ISO 16140-2.
Le protocole de validation doit clairement définir la/les gélose(s) sélective(s) à partir de laquelle/
desquelles les souches peuvent être confirmées à l’aide de la méthode alternative de confirmation.
Toutes les souches d’inclusivité et d’exclusivité doivent être soumises à essai. Dans les cas où certaines
souches ne peuvent pas se développer sur la/les gélose(s) sélective(s) spécifiée(s), une boîte de gélose
non sélective doit également être incluse dans l’étude comparative des méthodes et dans l’étude
interlaboratoires.
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ISO 16140-6:2019(F)
Les règles techniques applicables à l’étude comparative des méthodes et à l’étude interlaboratoires
sont données aux Articles 6 et 7. Les six cas suivants sont couverts; une distinction est faite entre la
confirmation/le typage de Salmonella et la confirmation/le typage d’autres micro-organismes:
— validation de méthodes utilisées pour la confirmation au niveau de la famille (non-Salmonella);
— validation de méthodes utilisées pour la confirmation au niveau du genre (non-Salmonella);
— validation de méthodes utilisées pour la confirmation au niveau de l’espèce (non-Salmonella);
— validation de méthodes utilisées pour la confirmation/le typage au niveau du (sous)type microbien
(non-Salmonella);
— validation de méthodes utilisées pour la confirmation/le typage au niveau de l’espèce ou du genre
Salmonella;
— validation de méthodes utilisées pour la confirmation/le typage au niveau du sérotype de Salmonella.
5 Souches
Les souches pures utilisées pour déterminer l’inclusivité et l’exclusivité doivent être correctement
caractérisées conformément à l’objectif de l’étude de validation. Les informations d’identification de
chaque souche seront utilisées pour confirmer (de façon complémentaire) le résultat si les résultats
du mode opératoire de confirmation de référence et ceux de la méthode alternative de confirmation
divergent.
NOTE Des laboratoires de référence nationaux, régionaux ou internationaux peuvent être contactés pendant
...
Questions, Comments and Discussion
Ask us and Technical Secretary will try to provide an answer. You can facilitate discussion about the standard in here.