ISO 26462:2010

INTERNATIONAL ISO
STANDARD 26462
IDF
214
First edition
2010-06-15


Milk — Determination of lactose
content — Enzymatic method using
difference in pH
Lait — Détermination de la teneur en lactose — Méthode enzymatique
par pH-métrie différentielle




Reference numbers
ISO 26462:2010(E)
IDF 214:2010(E)
©
ISO and IDF 2010

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ISO 26462:2010(E)
IDF 214:2010(E)
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Contents Page
Foreword .iv
Foreword .v
1 Scope.1
2 Terms and definitions .1
3 Principle .1
4 Reagents .1
5 Apparatus.3
6 Sampling .3
7 Preparation of test sample .3
8 Procedure.3
8.1 General .3
8.2 Blank determination.4
8.3 Calibration.4
8.4 Checking the calibration.5
8.5 Determination .5
8.6 Checking the stability .5
8.7 Cleaning procedure.5
9 Maintenance of the electrodes.6
9.1 Regeneration.6
9.2 Strong regeneration .6
10 Calculation and expression of results .6
10.1 Calculation .6
10.2 Expression of results.6
11 Precision .7
11.1 Interlaboratory test.7
11.2 Repeatability .7
11.3 Reproducibility .7
12 Test report.7
Annex A (informative) Basic diagram of a differential pH apparatus .8
Annex B (informative) Collaborative trial .9
Annex C (informative) Comparison between the pH and HPLC methods.10
Bibliography.11

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Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards
bodies (ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through
ISO technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has
been established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental
and non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 26462⎪IDF 214 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5,
Milk and milk products, and the International Dairy Federation (IDF). It is being published jointly by ISO and
IDF.

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Foreword
IDF (the International Dairy Federation) is a non-profit organization representing the dairy sector worldwide.
IDF membership comprises National Committees in every member country as well as regional dairy
associations having signed a formal agreement on cooperation with IDF. All members of IDF have the right to
be represented on the IDF Standing Committees carrying out the technical work. IDF collaborates with ISO in
the development of standard methods of analysis and sampling for milk and milk products.
The main task of Standing Committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the Standing Committees are circulated to the National Committees for endorsement prior to
publication as an International Standard. Publication as an International Standard requires approval by at least
50 % of IDF National Committees casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. IDF shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 26462⎪IDF 214 was prepared by the International Dairy Federation (IDF) and Technical Committee
ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 5, Milk and milk products. It is being published jointly by IDF
and ISO.
All work was carried out by the ISO-IDF Joint Project Group on Enzymatic determination of lactose of the
Standing Committee on Analytical methods for composition under the aegis of its project leader,
Mr. P. Trossat (FR).

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INTERNATIONAL STANDARD
IDF 214:2010(E)

Milk — Determination of lactose content — Enzymatic method
using difference in pH
1 Scope
This International Standard specifies an enzymatic method for the determination of the lactose content of milk
and reconstituted milk by measurement of the difference in pH (differential pH measurement).
2 Terms and definitions
For the purpose of this International Standard, the following terms and definitions apply.
2.1
lactose content in milk
amount of substance concentration of compounds determined by the procedure specified in this International
Standard
NOTE The lactose content of milk is expressed in millimoles per litre. For conversion of the result into other units, see
Table 1.
2.2
unit of enzyme activity
international unit
standard unit
U
amount of enzyme which catalyses the transformation of one micromole of substrate per minute under
standard conditions
3 Principle
β-Galactosidase is added to cleave lactose into glucose and galactose. At pH 7,8, glucose is phosphorylated
by glucokinase, thereby releasing protons that induce a change in pH. The pH change varies as a function of
the lactose content of the sample and is measured by using a differential pH analyser.
4 Reagents
During the analysis, unless otherwise stated, use only reagents of recognized analytical grade and distilled or
demineralized water or water of equivalent purity.
4.1 Buffer solution, pH 7,8
Dissolve 0,242 g of tris(hydroxymethyl)methylamine (tris), 0,787 g of adenosine 5′-triphosphate disodium salt
(ATP), 0,304 g of trisodium phosphate (Na PO ·12H O), 0,009 g of sodium hydroxide (NaOH), 0,203 g of
3 4 2
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IDF 214:2010(E)
1)
magnesium chloride hexahydrate (MgCl ·6H O), 2 g of octylphenoxypolyethoxyethanol [e.g. Triton X100 ],
2 2
1)
0,820 g of potassium chloride (KCl) and 0,010 g of 2-bromo-2-nitropropan-1,3-diol [e.g. Bronopol ] in a
100 ml beaker containing 50 ml of water under continuous stirring. Adjust the final pH to 7,8 ± 0,1, if needed.
Transfer to a 100 ml one-mark volumetric flask (5.4), make up to the mark with water and mix.
The buffer solution can be kept for 2 months if stored at 4 °C.
4.2 Enzyme solutions
4.2.1 Glucokinase enzyme solution
Dissolve 2,57 mg of lyophilized glucokinase-1 (GK1; 1 mg = 350 U; EC 2.7.1.2) in 3 ml of glycerol with a
volume fraction of 50 %. The activity of the glucokinase solution obtained shall be 290 U/ml ± 30 U/ml (see
2.2).
The glucokinase enzyme solution can be kept for 6 months if stored at 4 °C.
4.2.2 β-Galactosidase enzyme solution
Dilute a concentrated β-galactosidase (EC 3.2.1.23) extract purified from contaminating enzymes with glycerol
with a volume fraction of 50 %. The activity of the β-galactosidase solution obtained shall be
1 500 U/ml ± 200 U/ml.
The β-galactosidase enzyme solution can be kept for 6 months if stored at 4 °C.
4.3 Lactose standard solution (150 mmol/l)
Before use, determine the water content of lactose monohydrate powder by a Karl Fischer titration method, in
order to correct for the quantity of lactose monohydrate used for the lactose standard solution. The correction
should be based on the percentage of the determined water content in order to prepare a lactose standard
solution containing 5,404 g lactose monohydrate per 100 ml.
Dissolve 5,404 g lactose monohydrate powder, 0,745 g of potassium chloride (KCl) and 0,01 g of 2-bromo-2-
1)
nitropropan-1,3-diol [e.g. Bronopol ] in the buffer solution at pH 7,8 (4.1) in a 100 ml one-mark volumetric
flask (5.4). Make up to the mark with water and mix.
The lactose standard solution can be kept for 6 months if stored at 4 °C.
4.4 Cleaning solution
Dissolve 1,742 g of dipotassium monohydrogenphosphate (K HPO), 1,361 g of potassium
2 4
dihydrogenphosphate (KH PO ), 7,455 g of potassium chloride (KCl), 1,00 g of sodium azide (NaN ), 2 g of
2 4 3
1)
octylphenoxypolyethoxyethanol, 2 g of polyoxyethyleneglycol dodecylether [e.g. Brij 35 ] and 3 g of lauryl
1)
maltoside [e.g. LM ] in a 1 000 ml one-mark volumetric flask (5.4). Make up to the mark with water and mix.
The cleaning solution can be kept for 1 year if stored at room temperature.
4.5 Regenerating solution
Use a 0,1 mol/l hydrochloric acid (HCl) solution as regenerating solution.
The regenerating solution can be kept for 1 year if stored at room temperature.

1) Example of a suitable product available commercially. This information is given for the convenience of users of this
document and does not constitute an endorsement by ISO or IDF of this product.
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4.6 Strong regenerating solution
DANGER — The use of sodium fluoride (NaF) alone and in combination with HCl may cause health
problems due to inhalation and/or skin absorption. This International Standard does not purport to
address all the safety problems, if any, associated with its use. It is the responsibility of the user to
establish appropriate safety and health practices and to ensure compliance with any national
regulatory conditions.
Dissolve 30 g of nitric acid (HNO ) with a mass fraction, w(HNO ) ≈ 69 %, 30 g of hydrochloric acid (HCl) with
3 3
a mass fraction, w(HCl) ≈ 37 %, 30 g of sodium fluoride (NaF), and 1 g of octylphenoxypolyethoxyethanol in a
1 000 ml one-mark volumetric flask (5.6). Make up to the mark with water and mix.
The strong regeneration solution can be kept for 1 year if stored in non-corroding material at room
temperature.
5 Apparatus
Usual laboratory equipment and, in particular, the following.
5.1 Analytical balance, capable of weighing to the nearest 1 mg.
[5]
5.2 Micropipettes, capacity 20 µl, ISO 7550 , with positive displacement.
5.3 Water bath, capable of maintaining a temperature of 38 °C ± 1 °C.
[2]
5.4 One-mark volumetric flasks, capacities 100 ml and 1 000 ml, ISO 1042 class A.
5.5 Differential pH apparatus, shown schematically in Figure A.1.
The differential pH apparatus cons
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 26462
FIL
214
Première édition
2010-06-15



Lait — Détermination de la teneur en
lactose — Méthode enzymatique par pH-
métrie différentielle
Milk — Determination of lactose content — Enzymatic method using
difference in pH




Numéros de référence
ISO 26462:2010(F)
FIL 214:2010(F)
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ISO et FIL 2010

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FIL 214:2010(F)
Sommaire Page
Avant-propos .iv
Avant-propos .v
1 Domaine d'application .1
2 Termes et définitions .1
3 Principe .1
4 Réactifs.1
5 Appareillage .3
6 Échantillonnage.3
7 Préparation de l'échantillon pour essai .3
8 Mode opératoire.4
8.1 Généralités .4
8.2 Dosage du blanc.4
8.3 Étalonnage .5
8.4 Contrôle de l'étalonnage.5
8.5 Détermination .5
8.6 Contrôle de la stabilité.6
8.7 Nettoyage .6
9 Entretien des électrodes.6
9.1 Régénération.6
9.2 Régénération forte.6
10 Calcul et expression des résultats .7
10.1 Calcul.7
10.2 Expression des résultats.7
11 Fidélité .7
11.1 Essai interlaboratoires.7
11.2 Répétabilité .7
11.3 Reproductibilité .8
12 Rapport d'essai.8
Annexe A (informative) Schéma de l'appareillage de pH-métrie différentielle .9
Annexe B (informative) Essai interlaboratoires.10
Annexe C (informative) Comparaison des méthodes par CLHP et pH-métrie différentielle .11
Bibliographie.12

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ISO 26462:2010(F)
FIL 214:2010(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux
de normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général
confiée aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire
partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 26462⎪FIL 214 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité
SC 5, Lait et produits laitiers, et par la Fédération internationale de laiterie (FIL). Elle est publiée
conjointement par l'ISO et la FIL.

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FIL 214:2010(F)
Avant-propos
La FIL (Fédération Internationale de Laiterie) est une organisation sans but lucratif représentant le secteur
laitier mondial. Les membres de la FIL se composent des Comités Nationaux dans chaque pays membre et
des associations laitières régionales avec lesquelles la FIL a signé des accords de coopération. Tout membre
de la FIL a le droit de faire partie des Comités permanents de la FIL auxquels sont confiés les travaux
techniques. La FIL collabore avec l'ISO pour l'élaboration de méthodes normalisées d'analyse et
d'échantillonnage pour le lait et les produits laitiers.
La tâche principale des Comités permanents est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de
Normes internationales adoptés par les Comités permanents sont soumis aux Comités Nationaux pour
approbation avant publication en tant que Norme internationale. La publication comme Norme internationale
requiert l'approbation de 50 % au moins des Comités Nationaux de la FIL votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. La FIL ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 26462⎪FIL 214 a été élaborée par la Fédération Internationale de Laiterie (FIL) et le comité technique
ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 5, Lait et produits laitiers. Elle est publiée conjointement
par la FIL et l'ISO.
L'ensemble des travaux a été confié au groupe de projet mixte ISO-FIL sur la Détermination enzymatique du
lactose du Comité Permanent chargé des Méthodes d'analyse de la composition sous la conduite de son chef
de projet, Mr. P. Trossat (FR).

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ISO 26462:2010(F)
NORME INTERNATIONALE
FIL 214:2010(F)

Lait — Détermination de la teneur en lactose — Méthode
enzymatique par pH-métrie différentielle
1 Domaine d'application
La présente Norme internationale spécifie une méthode enzymatique de détermination de la teneur en lactose
du lait et du lait reconstitué, par mesurage de la différence de pH (pH-métrie différentielle).
2 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
2.1
teneur en lactose du lait
concentration en quantité de substance déterminée selon le mode opératoire spécifié dans la présente Norme
internationale
NOTE La teneur en lactose du lait est exprimée en millimoles par litre. Pour la conversion du résultat en d'autres
unités, voir le Tableau 1.
2.2
unité d'activité enzymatique
unité internationale
unité standard
U
quantité d'enzyme qui catalyse la transformation d'une micromole de substrat par minute dans des conditions
normales
3 Principe
Le lactose est coupé en glucose et en galactose par ajout de β-galactosidase. À pH 7,8, le glucose est
phosphorylé par la glucokinase, produisant ainsi des protons qui entraînent une variation du pH. Le pH varie
en fonction de la teneur en lactose de l'échantillon et la variation est mesurée à l'aide d'un analyseur à
pH-métrie différentielle.
4 Réactifs
Au cours de l'analyse, sauf indication contraire, utiliser uniquement des réactifs de qualité analytique
reconnue et de l'eau distillée ou déminéralisée ou de l'eau de pureté équivalente.
4.1 Solution tampon, pH 7,8
Dissoudre 0,242 g de tris(hydroxyméthyl)méthylamine (Tris), 0,787 g d'adénosine triphosphate sous forme de
sel disodique (ATP), 0,304 g de phosphate trisodique (Na PO ,12H O), 0,009 g d'hydroxyde de sodium
3 4 2
(NaOH), 0,203 g de chlorure de magnésium hexahydraté (MgCl ,6H O), 2 g d'octylphénoxypolyéthoxyéthanol
2 2
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1)
[par exemple Triton X100 ], 0,820 g de chlorure de potassium (KCl) et 0,010 g de 2-bromo-2-nitropropan-1,3-
1)
diol [par exemple Bronopol ] dans un bécher de 100 ml contenant 50 ml d'eau sous agitation continue.
Ajuster le pH final à 7,8 ± 0,1, si nécessaire. Transférer dans une fiole jaugée à un trait (5.4) de 100 ml,
compléter au trait avec de l'eau et mélanger.
La solution tampon peut être conservée pendant 2 mois si elle est stockée à 4 °C.
4.2 Solutions d'enzymes
4.2.1 Solution de glucokinase
Dissoudre 2,57 mg de glucokinase-1 lyophilisée (GK1; 1 mg = 350 U; EC 2.7.1.2) dans 3 ml de glycérol avec
une fraction volumique de 50 %. L'activité de la solution de glucokinase obtenue doit être de
290 U/ml ± 30 U/ml (voir 2.2).
La solution de glucokinase peut être conservée pendant 6 mois si elle est stockée à 4 °C.
4.2.2 Solution de β-galactosidase
Diluer un extrait concentré de β-galactosidase (EC 3.2.1.23), purifié des enzymes contaminants avec du
glycérol, avec une fraction volumique de 50 %. L'activité de la solution de β-galactosidase obtenue doit être
de 1 500 U/ml ± 200 U/ml.
La solution de β-galactosidase peut être conservée pendant 6 mois si elle est stockée à 4 °C.
4.3 Solution étalon de lactose (150 mmol/l)
Avant de l'utiliser, déterminer la teneur en eau de la poudre de lactose monohydraté par la méthode de titrage
Karl Fischer afin de corriger la quantité de lactose monohydraté utilisée pour la solution étalon de lactose. Il
convient d'apporter la correction en fonction du pourcentage de la teneur en eau déterminée, afin de préparer
une solution étalon de lactose contenant 5,404 g de lactose monohydraté par 100 ml.
Dissoudre 5,404 g de lactose monohydraté en poudre, 0,745 g de chlorure de potassium (KCl) et 0,01 g de
1)
2-bromo-2-nitropropan-1,3-diol [par exemple Bronopol ] dans la solution tampon de pH 7,8 (4.1) contenue
dans une fiole jaugée à un trait de 100 ml (5.4). Compléter au trait avec de l'eau et mélanger.
La solution étalon de lactose peut être conservée pendant 6 mois si elle est stockée à 4 °C.
4.4 Solution de nettoyage
Dissoudre 1,742 g de monohydrogénophosphate dipotassique (K HPO ), 1,361 g de dihydrogénophosphate
2 4
de potassium (KH PO ), 7,455 g de chlorure de potassium (KCl), 1,00 g d'azide de sodium (NaN ), 2 g
2 4 3
1)
d'octylphénoxypolyéthoxyéthanol, 2 g de polyoxyéthylèneglycol dodécyléther [par exemple Brij 35 ] et 3 g de
1)
lauryl maltoside [par exemple LM ] dans une fiole jaugée à un trait de 1 000 ml (5.4). Compléter au trait avec
de l'eau et mélanger.
La solution de nettoyage peut être conservée pendant une année si elle est stockée à température ambiante.
4.5 Solution de régénération
Utiliser une solution d'acide chlorhydrique (HCl) à 0,1 mol/l comme solution de régénération.
La solution de régénération peut être conservée pendant une année si elle est stockée à température
ambiante.

1) Exemple de produit approprié disponible sur le marché. Cette information est donnée à l'intention des utilisateurs du
présent document et ne signifie nullement que l'ISO ou la FIL approuvent ou recommandent l'emploi exclusif du produit
ainsi désigné.
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4.6 Solution de régénération forte
DANGER — L'utilisation du fluorure de sodium (NaF) seul et en combinaison avec de l'acide
chlorhydrique peut entraîner des problèmes de santé par inhalation et/ou par absorption par la peau.
La présente Norme internationale n'a pas pour but de traiter tous les problèmes de sécurité qui sont,
le cas échéant, liés à son utilisation. Il incombe à l'utilisateur de la présente Norme internationale
d'établir des pratiques appropriées en matière d'hygiène et de sécurité et de s'assurer de la
conformité à la réglementation nationale en vigueur.
Dissoudre 30 g d'acide nitrique (HNO ) avec une fraction massique, w(HNO ) ≈ 69 %, 30 g d'acide
3 3
chlorhydrique (HCl) avec une fraction massique, w(HCl) ≈ 37 %, 30 g de fluorure de sodium (NaF), et 1 g
d'octylphénoxypolyéthoxyéthanol dans une fiole jaugée à un trait de 1 000 ml (5.6). Compléter au trait avec de
l'eau et mélanger.
La solution de régénération forte peut être conservée pendant une année si elle est stockée dans un récipient
constitué d'un matériau résistant à la corrosion à température ambiante.
5 Appareillage
Matériel courant de laboratoire et, en particulier, ce qui suit.
5.1 Balance analytique, permettant de peser à 1 mg près.
[5]
5.2 Micropipettes, d'une capacité de 20 µl, ISO 7550 , à déplacement positif.
5.3 Bain-marie, pouvant être maintenu à une température de 38 °C ± 1 °C.
[2]
5.4 Fioles jaugées à un trait, d'une capacité de 100 ml et de 1 000 ml, ISO 1042 , classe A.
5.5 Appareillage de pH-métrie différentielle, représenté schématiquement à la Figure A.1.
L'appareillage de pH-métrie différentielle se compose de pompes péristaltiques pour la circulation des
liquides, d'une chambre de mélange, de deux électrodes capillaires à circulation en verre (E1 et E2), et d'un
système électronique de mesurage.
5.6 Fioles jaugées à un trai
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