ISO 6785:1985

Norme internationale
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION.MEX~YHAPOAHAR OPI-AHM3AWlR IlO CTAHAAPTM3Al&4VWORGANISATlON INTERNATIONALE DE NORMALISATION
Lait et produits laitiers - Recherche des Sa/mone//a
Milk and mifk products - De tection of Salmonefla
Première édition - 1985-11-15
Corrigée et réimprimée - 1985-12-15
Réf. no : ISO 67851985 (FI
iî CDU 637.V.3 : 579.67’842.14
-
Descripteurs : produit laitier, lait, analyse microbiologique, détection, salmonella.
0
m
Prix basé sur 13 pages

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Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale
d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de I’ISO). L’élaboration
des Normes internationales est confiée aux comités techniques de I’ISO. Chaque
comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité technique
créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouverne-
mentales, en liaison avec I’ISO participent également aux travaux.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis
aux comités membres pour approbation, avant leur acceptation comme Normes inter-
nationales par le Conseil de I’ISO. Les Normes internationales sont approuvées confor-
mément aux procédures de I’ISO qui requièrent l’approbation de 75 % au moins des
comités membres votants.
La Norme internationale ISO 6785 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34,
Produits agricoles alimentaires.
NOTE - La méthode spécifiée dans la présente Norme internationale a été élaborée
conjointement avec la Fédération internationale de laiterie (FIL) et l’Association des chimistes
analytiques officiels (AOAC) et sera également publiée par ces organisations.
L’attention des utilisateurs est attirée sur le fait que toutes les Normes internationales
sont de temps en temps soumises à révision et que toute référence faite à une autre
Norme internationale dans le présent document implique qu’il s’agit, sauf indication
contraire, de la dernière édition.
0 Organisation internationale de normalisation, 1985 l
Imprimé en Suisse

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NORME INTERNATIONALE ISO 67851985 (F)
Lait et produits laitiers - Recherche des Salmonella
1 Objet et domaine d’application 4.3 Isolement et identification
La présente Norme internationale spécifie une méthode de réfé- À partir des cultures obtenues (4.2), ensemencement des deux
rence pour la recherche des Salmonela dans le lait et les pro- milieux sélectifs solides (gélose au rouge de phénol et au vert
duits laitiers. brillant et gélose au sulfite de bismuth). 1)
Incubation à 37 OC et examen aprés 20 à 24 h, et si nécessaire,
après 40 à 48 h, pour contrôler s’il y a présence de colonies,
2 Référence
présumées être des Salmonela en raison de leurs caractéristi-
I S 0 707, Lait et produits laitiers - Méthodes d’échantillon-
ques.
nage.
4.4 Confirmation
3 Définitions
Repiquage des colonies présumées de Salmonella (4.3) et
confirmation au moyen des essais biochimiques et sérologiques
Dans le cadre de la présente Norme internationale, les défini-
appropriés.
tions suivantes sont applicables.
3.1 Salmonella : Micro-organismes formant des colonies typi-
5 Milieux de culture, réactifs et sérums
ques sur des milieux sélectifs solides et possédant des caracté-
ristiques biochimiques et sérologiques décrites lorsque les
essais sont effectués conformément à la présente Norme inter-
5.1 Composants de base
nationale.
Pour améliorer la reproductibilité des résultats, il est recom-
mandé d’utiliser pour la préparation des milieux de culture, des
3.2 recherche des Salmonella: Détermination de la pré-
composants de base déshydratés ou des milieux complets
sence ou de l’absence de ces micro-organismes dans une
déshydratés. Les prescriptions du fabricant doivent être suivies
masse ou un volume déterminé de produit, lorsque l’essai est
scrupuleusement.
exécuté selon la présente Norme internationale.
Les produits chimiques utilisés pour la préparation des milieux
de culture et des réactifs doivent être de qualité analytique
4 Principe
reconnue.
En général, la recherche des Salmonella nécessite quatre pha-
L’eau utilisée doit être de l’eau distillée ou déminéralisée, et être
ses successives telles qu’indiquées en 4.1 à 4.4. Voir également
le schéma du mode opératoire dans l’annexe. exempte de substances susceptibles d’inhiber la croissance des
micro-organismes dans les conditions de l’essai.
4.1 Préenrichissement dans un milieu liquide
Lorsque la gélose est spécifiée, la quantité utilisée doit varier
conformément aux instructions du fabricant pour donner des
Ensemencement de la prise d’essai dans le milieu de
milieux d’une fermeté appropriée.
préenrichissement approprié, puis incubation à 37 OC durant 16
à 20 h.
Les mesurages de pH doivent être effectués à l’aide d’un
pH-mètre, ces mesurages se référant à une température de
4.2 Enrichissement dans des milieux liquides
25 OC. Les ajustements éventuels sont faits par addition, soit
sélectifs d’une solution d’acide chlorhydrique à 1 mol/l, soit d’une solu-
tion d’hydroxyde de sodium à 1 mol/l.
Ensemencement d’un milieu au tétrathionate et d’un milieu
sélénite-cystine avec la culture obtenue (4.1). Incubation du Si les milieux de culture préparés et les réactifs ne sont pas utili-
milieu au tétrathionate à 43 OC et incubation du milieu sélénite-
sés extemporanément, ils doivent, sauf spécifications contrai-
cystine à 37 OC durant deux périodes de 18 à 24 h.
res, être conservés à l’obscurité, à une température comprise
1) La gélose au sulfite de bismuth permet de recueillir des souches de Salmonek fermentant le lactose.
1

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ISO 67854985 (FI
5.2.2.2 Solution de thiosulfate de sodium
entre 0 et +5 OC, pendant 1 mois au maximum, dans des con-
ditions qui évitent toute modification de leur composition.
Composition
NOTE - Les systèmes de diagnostic rapide disponibles dans le com-
merce peuvent être utilisés à la place des milieux énumérés en 5.2.7, Thiosulfate de sodium pentahydraté
5.2.8, 5.2.9 et 5.3; voir cependant 9.4.4.
(Na2S203.5HzO)
560 g
100 ml
Eau, quantité suffisante pour
Préparation
5.2 Milieux de culture
Dissoudre le thiosulfate de sodium dans une partie de l’eau.
5.2.1 Milieu préenrichissement: eau peptonée
Compléter au volume final.
tamponnée
Stériliser la solution durant 15 min à 121 + 1 OC.
Composition
5.2.2.3 Solution d’iode
Peptone lO,O g
Chlorure de sodium
5,o g
Composition
Hydrogéno-orthophosphate disodique
dodécahydraté (Na2HP0,. 12H20) w 9
Iode 2w g
Dihydrogéno-orthophosphate de potassium
Iodure de potassium 25,o g
KH2P0,) 115 g
100 ml
Eau, quantité suffisante pour
1 000 ml
Eau
Préparation
Préparation
Dissoudre l’iodure de potassium dans un petit volume d’eau
Dissoudre les composants dans l’eau en portant à ébullition.
et ajouter l’iode.
Ajuster le pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de
Agiter jusqu’à dissolution complète.
7,0 $r 0,l.
Compléter au volume final.
Répartir le milieu, par quantités de 225 ml, dans des flacons
de 500 ml de capacité (ou des multiples de 225 ml dans des
Conserver la solution dans un récipient opaque complète-
flacons de capacité adéquate).
ment fermé.
Stériliser le milieu durant 15 min à 121 + 1 OC.
5.2.2.4 Solution de vert brillant
Composition
52.2 Premier milieu d’enrichissement sélectif:
bouillon au tétrathionate ( Muller-Kauff mann)
Vert brillant
015 g
100 ml
Eau
5.2.2.1 Milieu de base
Préparation
Composition
Ajouter le vert brillant à l’eau.
Extrait de viande 50 9
Conserver la solution au moins une journée à l’obscurité
Peptone
lO,O g
pour permettre l’autostérilisation.
Chlorure de sodium 310 g
Carbonate de calcium
4510 g
1000 ml
Eau
5.2.2.5 Solution de bile de boeuf
Composition
Préparation
10,o g
Bile de boeuf desséchée
Ajouter les composants de base déshydratés ou le milieu de
100 ml
Eau
base complet déshydraté à l’eau, en portant et maintenant à
ébullition jusqu’à dissolution complète des composants
Préparation
solubles.
Dissoudre la bile de boeuf desséchée dans l’eau en portant à
Ajuster le pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de
ébullition.
7,0 zk 0,l.
Stériliser la solution durant 15 min à 121 + 1 OC.
Stériliser le milieu de base durant 15 min à 121 + 1 OC.
2

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60 67854985 (FI
5.2.2.6 Milieu complet Préparation
Compléter à 100 ml avec de l’eau stérile dans une fiole
Composition
stérile.
900 ml
Milieu de base (5.2.2.1)
Ne pas stériliser à l’autoclave
Solution de thiosulfate de sodium (5.2.2.2) 100 ml
Solution d’iode (5.2.2.3) 20 ml
Solution de vert brillant (5.2.2.4) 2 ml 5.2.3.3 Milieu complet
Solution de bile de boeuf (5.2.2.5) 50 ml
Refroidir le milieu de base et ajouter stérilement la solution de
L-cystine à raison de 0,l ml pour 10 ml de milieu de base.
Prépara tion
Ajuster le pH, si nécessaire, à 7,0 k 0,l.
Ajouter stérilement au milieu de base les autres composants
dans l’ordre donné ci-dessus.
Ne pas stériliser à l’autoclave.
Bien mélanger les liquides aprés chaque addition.
Répartir stérilement le milieu, par quantités nécessaires pour
l’essai, dans des flacons stériles de capacité adéquate.
Répartir stérilement le milieu complet, par quantités de
100 ml, dans des flacons stériles de 500 ml de capacité.
Utiliser le milieu le jour même de sa préparation.
Conserver à O-5 OC à l’obscurité mais utiliser dans la
semaine qui suit la préparation. 5.2.4 Premier milieu d’identification: gelose au rouge
de phénol et au vert brillant (Edel & Kampelmacher)
5.2.3 Deuxième milieu d’enrichissement selectif :
5.2.4.1 Milieu de base
bouillon au sélénite-cystine
Composition
AVERTISSEMENT - II convient d’être très prudent lors
de l’utilisation en laboratoire de solutions de sélénite en
Extrait de viande en poudre
510 g
raison de leur effet toxique potentiel. En âucun cas, il ne
Peptone no g
faut pipetter avec la bouche.
Extrait de levure en poudre
3,O g
Hydrogéno-orthophosphate disodique
5.2.3.1 Milieu de base
(Na2HPO,J l,O g
Dihydrogéno-orthophosphate de sodium
( NaH2P04) Of6 g
Composition
Agar-agar 12,0 à 18,0 g 1)
Eau 900 ml
Tryptone
50 g
Lactose
4,o g
Préparation
Hydrogéno-orthophosphate disodique (Na2HP04)
lO,O g
Hydrogénosélénite de sodium
4,o g
Dissoudre les composants de base déshydratés ou le milieu
1 000 ml
Eau
\
de base complet déshydraté dans l’eau, en portant à ébulli-
tion.
Préparation
Ajuster le pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de
Dissoudre les trois premiers ingrédients dans l’eau en por-
7,0 + 0,l.
tant et maintenant à ébullition durant 5 min. Après refroidis-
sement ajouter I’hydrogénosélénite de sodium.
Répartir le milieu de base dans des de
500 ml de capacité maximale.
Ajuster le pH à 7,0 It 0,l.
Stériliser durant 15 min à 121 + 1 OC.
Ne pas stériliser à l’autoclave.
5.2.4.2 Solution de sucres au rouge de phénol
5.2.3.2 Solution de L-cystine
Composition
Composition
10,o g
Lactose
L-cystine Saccharose no g
Cl g
Hydroxyde de sodium, solution,
Rouge de phénol o,a g
100 ml
c(NaOH) = 1 mol/1 15 ml Eau, quantité suffisante pour
Se conformer aux instructions du fabricant.
1)

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IsO 6785-1985 (FI
Refroidir entre 45 et 50 OC en agitant doucement le précipité
Préparation
en suspension.
Dissoudre les ingrédients dans l’eau.
Ne pas stériliser le milieu.
Chauffer au bain d’eau durant 20 min à 70 OC.
Répartir le milieu, par quantités de 20 ml, dans des boîtes de
Petri stériles (de 90 mm de diamètre) et laisser se solidifier.
Refroidir à 55 OC et utiliser immédiatement.
Juste avant l’emploi, sécher soigneusement les boîtes de
5.2.4.3 Milieu complet
milieu gélosé, de préférence après avoir retiré les couvercles
et retourné les boîtes, dans une étuve ou un incubateur
Composition
réglé à 50 + 5 OC durant 30 min.
900 ml
Milieu de base (5.2.4.1)
Utiliser les boîtes séchées entre 24 et 48 h après leur prépa-
100 ml
Solution de sucres au rouge de phénol (5.2.4.2)
ration. Les conserver à l’obscurité.
1 ml
Solution de vert brillant (5.2.2.4)
5.2.6 G&lose nutritive
Préparation
Composition
la solution
Ajouter stérilement la solution de vert brillant à
de phénol refroidie à 55 OC.
de sucres au rouge
Extrait de viande 310 g
Peptone 510 g
maintenu à 50-55 OC et
Ajouter a u milieu de base fondu et
Agar-agar 12,0 g
mélanger
1 000 ml
Eau
5.2.4.4 Préparation des boîtes
Préparation
Répartir le milieu complet refroidi à 45 OC, par quantités d’envi-
Dissoudre les composants déshydratés du milieu ou le
ron 15 ml, dans des boîtes de Petri stériles de 90 mm de diamè-
milieu complet déshydraté dans l’eau, en portant à ébulli-
tre et laisser se solidifier.
tion.
Juste avant l’emploi, sécher soigneusement les boîtes de milieu Ajuster le pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de
gélosé, de préférence après avoir retiré les couvercles et 7,0 + 0,l.
retourné les boîtes, dans une étuve ou un incubateur réglé à
Répartir le milieu de culture dans des tubes ou des flacons
50 I!I 5 OC durant 30 min.
stériles de 500 ml de capacité maximale.
Les boîtes de milieu gélosé non séchées ne doivent pas être
Stériliser le milieu durant 20 min à 121 + 1 OC.
conservées plus de 4 h à la température du laboratoire ou plus
de 24 h à O-5 OC.
Préparation des boîtes de gélose nutritive
5.2.5 Second milieu d’identification : gélose au sulfite
Verser environ 15 ml du milieu fondu dans des boîtes de
de bismuth
Petri stériles (de 90 mm de diamètre) et procéder comme
spécifié en 5.2.4.4.
Composition
Peptone lOtO g 5.2.7 Gélose au citrate de fer et aux trois sucres
Extrait de boeuf 5,O g (gélose TSI)
Glucose 5,O g
Hydrogéno-orthophosphate disodique 4,o g Composition
Sulfate de fer( I 1) 013 9
Extrait de viande 3,O cl
Citrate de bismuth ammoniacaIl) 1,35 g
Extrait de levure 310 $3
Sulfite de sodium 1) 615 g
Peptone 20,o g
Agar-agar mo g
Chlorure de sodium 5,O g
0,025 g
Vert brillant
Lactose lO,O $3
1 000 ml
Eau
10,o g
Saccharose
Glucose LO g
Préparation
Citrate de ferI II 1) 03 g
Thiosulfate de sodium 0,3 g
dre les ingrédients dans l’eau, en portant à ébullition
Dissou
0,024 g
Rouge de phénol
durant environ 1 min.
Agar-agar 12,o g
Eau 1000 ml
Ajuster le pH à 7,7 k 0,l.
1) Au lieu de ces composants, 8 g d’indicateur au sulfite de bismuth TBi(SO,),l peuvent être utilisés.
4

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ISO 67854985 (FI
5.2.8.3 Milieu complet
Préparation
Composition
Dissoudre les composants du milieu déshydratés ou le
milieu complet déshydraté dans l’eau, en portant à ébulli-
Milieu de base (5.2.8.1) 950 ml
tion.
Solution d’urée (5.2.8.2) 50 ml
Ajuster le pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de
Préparation
7,4 + 0,l.
Ajouter stérilement la solution d’urée au milieu de base préa-
Répartir le milieu, par quantités de 10 ml, dans des tubes de
lablement fondu puis refroidi à 45 OC.
17 à 18 mm de diamètre.
Répartir le milieu complet, par quantités de 10 ml, dans des
Stériliser le milieu durant 10 min à 121 + 1 OC.
tubes stériles.
n
en position inclinée de facon à obtenir u
Laisser reposer
Laisser reposer en position inclinée.
4 à 5 cm.
culot de 2,5 cm de profondeur et une pente de
5.2.9 Milieu de décarboxylation à la lysine
Composition
(Christensen)
5.2.8 Gélose pour la recherche à I’uréase
Monohydrochlorure de L-lysine 510 g
Extrait de levure
310 g
5.2.8.1 Milieu de base
Glucose l,O g
Pourpre de bromocrésol 0,015 g
Composition
Eau 1 000 ml
Peptone w g Préparation
Glucose
w g
Chlorure de sodium Dissoudre les composants dans l’eau, en portant à ébulli-
510 9
Dihydrogéno-orthophosphate de potassium tion.
KH2P04) 2,o g
0,012 g
Rouge de phénol Ajuster le pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de
Agar-agar 15,O g 6,8 + 0,l.
Eau 1 000 ml
Répartir le milieu, par quantités de 5 ml, dans des tubes de
culture d’environ 8 mm de diamètre et 160 mm de longueur.
Préparation
Stériliser le milieu durant 10 min à 121 + 1 OC.
Dissoudre les composants de base déshydratés ou le milieu
de base complet déshydraté dans l’eau, en portant à ébulli-
tion.
5.3 Réactifs
Ajuster le pH si nécessaire, de sorte qu’après stérilisation, il
soit de 6,8 k 0,l.
5.3.1 Solution saline
Stériliser le milieu de base durant 15 min à 121 + 1 OC.
Composition
Chlorure de sodium
8,5 g
5.2.8.2 Solution d’urée
1000 ml
Eau
Composition
Préparation
Urée
4wl
Dissoudre le chlorure de sodium dans l’eau, en portant à
Eau, quantité suffisante pour 1 000 ml
ébullition.
Ajuster le pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de
Préparation
7,0 z!l 0,l. .
Dissoudre l’urée dans l’eau.
Répartir la solution dans des flacons ou dans des tubes, de
sorte qu’après stérilisation, ils contiennent 90 à 100 ml de
Stériliser par filtration et contrôler la stérilité. (Pour les
solution.
détails relatifs à la technique de stérilisation par filtration,
faire référence à tout manuel approprié de microbiologie.)
Stériliser la solution durant 15 min à 121 + 1 OC.
. 5

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ISO 67854985 (FI
Préparation
5.3.2 Réactifs pour la recherche de P-galactosidase 1)
Dissoudre les composants dans l’eau.
5.3.2.1 Toluène
Ajuster le pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de
6,9 + 0,l.
5.3.2.2 Solution tampon
Répartir 3 ml de milieu dans chacun des tubes.
Composition
Stériliser le milieu durant 15 min au maximum, à
Dihydrogéno-orthophosphate de sodium
121 + 1 OC.
6,9 g
(NaH2P04)
Hydroxyde de sodium,
3 ml (environ)
solution à environ 0,l mol/1
5.3.3.2 Solution de créatine
50 ml
Eau, quantité suffisante pour
Composition
Préparation
015 g
Créatine monohydratée UV-amidinosarcosine)
Dissoudre le dihydrogéno-orthophosphate de sodium dans 100 ml
Eau
environ 45 ml d’eau.
Préparation
Ajuster le pH à 7,0 + 0,l avec environ 3 ml de la solution
d’hydroxyde de sodium.
Dissoudre la créatine monohydratée dans l’eau.
Compléter à 50 ml avec de l’eau.
5.3.3.3 Solution éthanolique de naphtol-1
5.3.2.3 Solution d’ONPG
Composition
Composition
Naphtol-1 6!3
100 ml
Éthanol, à 96 % (Vl v)
Orthonitrophényl-P-D-galactopyranoside (ONPG) 08 g
15 ml
Eau
Prépara tion
Préparation
Dissoudre le naphtol-1 dans I’éthanol.
Dissoudre I’ONPG dans l’eau à 50 OC.
5.3.3.4 Solution d’hydroxyde de potassium
Refroidir la solution.
Composition
5.3.2.4 Réactif complet
Hydroxyde de potassium WI
100 ml
Eau
Composition
Préparation
5 ml
Solution tampon (5.3.2.2)
15 ml
Solution d’ONPG (5.3.2.3)
Dissoudre l’hydroxyde de potassium dans l’eau.
Préparation
5.3.4 Réactifs pour la réaction de I’indole
Ajouter la solution tampon à la solution d’ONPG
5.3.4.1 Milieu tryptone-tryptophane (de Ljutov)
Voges- Proska
ur la réaction de
5.3.3 Réactifs
PO
(méthode rapide de Barry et Feeney)
Composition
Tryptone 10 g
5.3.3.1 Milieu VP
Chlorure de sodium 5g
DL-Tryptophane lg
Composition
1000 ml
Eau
TO g
Peptone
Préparation
Glucose 5s) g
Hydrogéno-orthophosphate dipotassique
Dissoudre les composants dans l’eau, en portant à ébulli-
50 g
K,HP04)
1 000 ml tion, et filtrer.
Eau
1) Un disque imprégné de P-galactosidase disponible dans le commerce peut être utilisé.
6

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ISO 67854985 (F)
sérums préparés par un fournisseur dont la compétence est
Ajuster le pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de
reconnue (par exemple, un organisme gouvernemental appro-
7,5 * 0,l.
. II
prié).
Répartir 5 ml de milieu dans chacun des tubes.
Stériliser le milieu durant 15 min à 121 + 1 OC.
6 Appareillage et verrerie
5.3.4.2 Réactif de Kovacs
Matériel courant de laboratoire de microbiologie, et notam-
ment :
Composition
Diméthylamino-4 benzaldéhyde
5g
6.1 Appareillage
25 ml
Acide chlorhydrique, Q 1,18 à 1,19 g/ml
75 ml
Méthyl-2 butanol-
6.1.1 Appareils pour la stérilisation en chaleur sèche
Préparation (four) ou en chaleur humide (autoclave).
Mélanger les composants. Le matériel en contact avec les milieux de culture, le diluant et
l’échantillon, sauf s’il est livré stérile (particulièrement celui en
plastique), doit être stérilisé
5.3.5 Gélose nutritive semi-solide
-
soitau four en le maintenant à une température comprise
Composition
entre 170 et 175 OC durant au moins 1 h;
Extrait de viande
3,O g
-
soit à l’autoclave en le maintenant à une température de
Peptone 5,O g
121 + 1 OC durant au moins 20 min.
Agar-agar 4à9 g’)
1000 ml
Eau
Un autoclave est également nécessaire pour la stérilisation des
milieux de culture et des réactifs. II doit être réglable à
Préparation
121 + 1 OC et à 115 + 1 OC.
Dissoudre les composants de déshyd l’eau,
en portant à ébullition.
6.1.2 Enceinte de séchage, étuve ou incubateur,
ventilé(e) (permettant de sécher la surface des milieux gélosés
Ajuster le pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de
coulés en boîte), réglable à 50 + 5 OC.
7,0 * 0,l.
flacons de 500 ml de capacité
Répartir le milieu
6.1.3 Incubateur, réglable à 37 + 1 OC.
maximale.
Stériliser le milieu durant 15 min à 121 I!I 1 OC. 6.1.4 Incubateur, réglable à 43 k 0,5 OC.
Préparation des boîtes de gélose
6.1.5 Bains d’eau, réglables à 45 + 1 OC et à 37 + 1 OC.
Répartir le milieu complet, récemment préparé, dans des
boîtes de Petri (de 90 mm de diamètre) par quantités d’envi-
6.1.6 Homogénéisateurs
ron 15 ml. Les boîtes ne doivent pas être séchées.
L’un des appareils suivants doit être utilisé:
5.4 Sérums
a) homogénéisateur rotatif, fonctionnant à une fré-
quence de rotation comprise entre 8 000 et 45 000 min -1,
On peut trouver dans le commerce plusieurs sérums anti-Sal-
avec des récipients en verre ou en métal, munis de préfé-
monella c’est-à-dire des anti-sérums contenant un ou plusieurs
rence de couvercles et résistant aux conditions de stérilisa-
groupes ((0)) (dénommés anti-sérums 0 monovalents ou poly-
tion;
valents), des anti-sérums Vi et des anti-sérums contenant des
anticorps pour un ou plusieurs facteurs «H» (dénommés anti-
b) homogénéisateur de type péristaltique, avec des
sérums H monovalents ou polyvalents). Pour chaque sérum,
sacs en plastique stériles.
suivre les instructions d’utilisation données par le fabricant.
NOTE - Les récipients ou les sacs en plastique doivent être de capa-
Tous les’essais devront être faits afin de s’assurer que les anti-
cité suffisante pour permettre le mélange correct de l’échantillon pour
sérums utilisés conviennent pour la recherche de tous les séro-
essai avec le diluant. En général, le volume du récipient doit être égal à
types de SalmoneRa. Dans ce but on pourra se servir d’anti-
environ deux fois le volume de l’échantillon et du diluant.
1) Se conformer aux instructions du fabricant.
7

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ISO 67854985 (FI
6.1.7 Anses bouclées, en platine iridié ou en nickel- chrome, organismes, en inversant rapidement 25 fois le récipient avec
d’environ 3 mm de diamètre. l’échantillon. II faut éviter la formation de mousse ou bien la
laisser se disperser. L’intervalle entre le mélange et le prélève-
ment de l’échantillon pour essai ne doit pas dépasser 3 min.
82 . Lait sec, poudre de lactosé rum, ba
aséine
en poudre, lactose, c
6.1.9 Réfrigérateur (permettant de conserver les milieux et
Mélanger soigneusement le contenu du récipient fermé, en
réactifs préparés), réglable à O-5 OC.
secouant manuellement et en inversant de facon répétée. Si le
récipient est trop rempli pour permettre une agitation vigou-
6.2 Verrerie
reuse, prendre un récipient plus grand. Mélanger.
La verrerie doit pouvoir résister à des stérilisations répétées.
8.3 Beurre
6.2.1 Flacons de CU lture 1) pour la stérilisation et la conser-
f
Faire fondre l’échantillon dans un récipient stérile dans un bain
milieux liqui-
vation des milieux de culture et l’incubation des
d’eau maintenu à 45 + 1 OC (6.1.5). Agiter lorsqu’on fait fon-
des.
dre et retirer le récipient immédiatement du bain d’eau lorsque
l’échantillon vient d’être fondu.
6.2.2 Tubes de culture, de 8 mm de diamètre et 160 mm de
longueur, pour le milieu de décarboxylation à la lysine.
8.4 Fromage
6.2.3 Éprouvettes graduées, pour la préparation des milieux
Habituellement, l’échantillon pour laboratoire (prélevé confor-
complets.
mément à I’ISO 707) constituera l’échantillon pour essai. Pro-
céder alors comme décrit en 9.1.5.
6.2.4 Pipettes graduées, de 25, 10 et 1 ml de capacités
nominales, graduées respectivement en 0,5, Of5 et Of1 ml.
85 . Glaces de consommation
Procéder comme dans le cas du beurre (8.3), mais en utilisant
6.2.5 Boîtes de Petri, comme suit:
un bain d’eau maintenu au maximum à 37 OC (6.1.51, du fait
que l’échantillon ne doit pas dépasser cette température.
diamétre extérieur 90*2mm
18 mm
hauteur extérieure, minimum
.
86 Lait fermenté, yaourt, crèmes, desserts
Le bord doit être rodé dans un plan parallèle à la base.
Mélanger le contenu du récipient fermé, en secouant manuelle-
Le fond de la boîte doit être plat et parallèle à la base.
ment et en inversant de facon répétée, ou ouvrir le récipient et
mélanger le contenu stérilement à l’aide d’une spatule ou d’une
Couvercle, muni d’un rebord
cuillère stérile.
102 mm
diamétre extérieur, maximum
être utili-
NOTE - Des boîtes de Petri en plastique peuvent également
9 Mode opératoire
sées, même si leurs dimensions sont légèrement différentes.
Voir les mesures de sécurité au chapitre 12.
7 Échantillonnage
91 . Prise d’essai et préenrichissement
Voir ISO 707.
Introduire la prise d’essai dans le milieu de préenrichissement et
Suivre les instructions d’échantillonnage pour des analyses opérer comme décrit en 9.1 .l à 9.1.7.
microbiologiques.
nrichis-
Pour une récapitulation des modes opératoires de prée
se reporter au tableau 1.
sement et d’enrichissement,
8 Préparation de l’échantillon pour essai
9.1 .l Lait
8.1 Lait
Un préenrichissement n’est pas nécessaire. Se reporter à 9.2,
Agiter vigoureusement l’échantillon pour essai afin d’ assurer en utilisant 25 ml de l’échantillon pour essai et 225 ml du milieu
uniforme que possible des micro- d’enrichissement, respectivement.
une répartition aussi
Des flacons à capsule métallique à vis peuvent être utilisés.
1)
8

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ISO 67854985 (FI
9.1.2 Lait sec soudre ou disperser dans 2,25 litres de milieu de préenrichissement; ou
bien encore on peut réunir les portions de 10 ml de milieu de préenri-
chissement provenant des 10 prises d’essai séparées pour enrichir
Préparer un flacon bouché contenant 225 ml d’eau distillée
1 litre de milieu d’enrichissement sélectif.
stérile et 1 ml de la solution de vert brillant (5.2.2.4). Peser
stérilement 25 g de l’échantillon pour essai et le verser à la
2 Sauf spécification contraire, contrôler le pH de la suspension et
surface du liquide dans le flacon. Boucher le flacon, mais ne l’ajuster, si nécessaire, à 6,8.
pas l’agiter. Laisser reposer à la température ambiante durant
60 + 10 min avant incubation. L’ajustement du pH n’est pas
9.1.9 Incubation
nécessaire. Si après 3 h d’incubation, le lait sec n’est pas
encore dissous, mélanger le contenu du flacon par agitation.
Incuber les flacons préparés conformément de 9.1.2 à 9.1.8, à
37 OC durant 16 à 20 h.
9.1.3 Lait sec, babeurre sec
Peser stérilement 25 g de l’échantillon pour essai dans un fla-
9.2 Enrichissement
con bouché contenant 225 ml d’eau distillée stérile. Agiter
jusqu’à dissolution et ajouter 1 ml de la solution de vert brillant
9.2.1 Transférer, à l’aide d’une pipette, 10 ml du milieu de
(5.2.2.4).
préenrichissement incubé (9.1) dans un flacon contenant
100 ml du milieu d’enrichissement sélectif au tétrathionate
9.1.4 Lactose
(5.2.2); transférer de même 10 ml du milieu de préenrichisse-
ment incubé dans un flacon contenant 100 ml de sélénite-
Peser stérilement 25 g de l’échantillon pour essai dans un fla-
cystine (5.2.3).
con bouché contenant 225 ml du milieu de préenrichissement
(5.2.1) et agiter jusqu’à dissolution.
Dans le cas du lait, transférer stérilement 25 ml de l’échantillon
pour essai dans 225 ml du milieu au tétrathionate (5.2.21, et
également 25 ml dans 225 ml du milieu au sélénite-cystine
9.1.5 Caséine, fromage
(5.2.3).
Peser stérilement 25 g de l’échantillon pour essai dans le réci-
pient stérile d’un homogénéisateur à grande vitesse ou de type
9.2.2 Incuber le milieu au tétrathionate inoculé durant 18
péristaltique (6.1.6) et ajouter 225 ml du milieu de préenrichis-
à 24 h à 43 + Of5 OC, et le milieu au sélénite-cystine inoculé
sement (5.2.1) à 45 OC. Mélanger jusqu’à ce que la prise d’essai
durant 18 à 24 h à 37 k 1 OC.
soit totalement dispersée (1 à 3 min). SIassurer que la tempéra-
ture de dispersion ne dépasse pas 45 OC.
9.3 Ensemencement et identification
9.1.6 Beurre
9.3.1 Ensemencer avec une anse, à partir de la culture de cha-
Agiter l’échantillon pour essai fondu et, à l’aide d’une pipette,
que milieu d’enrichissement, la surface d’une boîte de gélose au
portée à environ 45 OC, en introduire 25 ml dans un flacon con-
vert brillant et au rouge de phénol (5.2.4) et d’une boîte de
tenant 225 ml du milieu de préenrichissement (5.2.1). Mélan-
gélose au sulfite de bismuth (5.2.5), de facon à permettre le
ger.
développement de colonies bien isolées. Remettre les milieux
d’enrichissement en incubation (voir 9.3.3).
.7 Produits laitiers congelés (y compris glaces
9.1
de consommation)
9.3.2 Incuber les boîtes (retournées) à 37 + 1 OC durant 20 à
24 h.
Introduire,
...

Norme internationale
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION.MEX~YHAPOAHAR OPI-AHM3AWlR IlO CTAHAAPTM3Al&4VWORGANISATlON INTERNATIONALE DE NORMALISATION
Lait et produits laitiers - Recherche des Sa/mone//a
Milk and mifk products - De tection of Salmonefla
Première édition - 1985-11-15
Corrigée et réimprimée - 1985-12-15
Réf. no : ISO 67851985 (FI
iî CDU 637.V.3 : 579.67’842.14
-
Descripteurs : produit laitier, lait, analyse microbiologique, détection, salmonella.
0
m
Prix basé sur 13 pages

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Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale
d’organismes nationaux de normalisation (comités membres de I’ISO). L’élaboration
des Normes internationales est confiée aux comités techniques de I’ISO. Chaque
comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du comité technique
créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non gouverne-
mentales, en liaison avec I’ISO participent également aux travaux.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques sont soumis
aux comités membres pour approbation, avant leur acceptation comme Normes inter-
nationales par le Conseil de I’ISO. Les Normes internationales sont approuvées confor-
mément aux procédures de I’ISO qui requièrent l’approbation de 75 % au moins des
comités membres votants.
La Norme internationale ISO 6785 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34,
Produits agricoles alimentaires.
NOTE - La méthode spécifiée dans la présente Norme internationale a été élaborée
conjointement avec la Fédération internationale de laiterie (FIL) et l’Association des chimistes
analytiques officiels (AOAC) et sera également publiée par ces organisations.
L’attention des utilisateurs est attirée sur le fait que toutes les Normes internationales
sont de temps en temps soumises à révision et que toute référence faite à une autre
Norme internationale dans le présent document implique qu’il s’agit, sauf indication
contraire, de la dernière édition.
0 Organisation internationale de normalisation, 1985 l
Imprimé en Suisse

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NORME INTERNATIONALE ISO 67851985 (F)
Lait et produits laitiers - Recherche des Salmonella
1 Objet et domaine d’application 4.3 Isolement et identification
La présente Norme internationale spécifie une méthode de réfé- À partir des cultures obtenues (4.2), ensemencement des deux
rence pour la recherche des Salmonela dans le lait et les pro- milieux sélectifs solides (gélose au rouge de phénol et au vert
duits laitiers. brillant et gélose au sulfite de bismuth). 1)
Incubation à 37 OC et examen aprés 20 à 24 h, et si nécessaire,
après 40 à 48 h, pour contrôler s’il y a présence de colonies,
2 Référence
présumées être des Salmonela en raison de leurs caractéristi-
I S 0 707, Lait et produits laitiers - Méthodes d’échantillon-
ques.
nage.
4.4 Confirmation
3 Définitions
Repiquage des colonies présumées de Salmonella (4.3) et
confirmation au moyen des essais biochimiques et sérologiques
Dans le cadre de la présente Norme internationale, les défini-
appropriés.
tions suivantes sont applicables.
3.1 Salmonella : Micro-organismes formant des colonies typi-
5 Milieux de culture, réactifs et sérums
ques sur des milieux sélectifs solides et possédant des caracté-
ristiques biochimiques et sérologiques décrites lorsque les
essais sont effectués conformément à la présente Norme inter-
5.1 Composants de base
nationale.
Pour améliorer la reproductibilité des résultats, il est recom-
mandé d’utiliser pour la préparation des milieux de culture, des
3.2 recherche des Salmonella: Détermination de la pré-
composants de base déshydratés ou des milieux complets
sence ou de l’absence de ces micro-organismes dans une
déshydratés. Les prescriptions du fabricant doivent être suivies
masse ou un volume déterminé de produit, lorsque l’essai est
scrupuleusement.
exécuté selon la présente Norme internationale.
Les produits chimiques utilisés pour la préparation des milieux
de culture et des réactifs doivent être de qualité analytique
4 Principe
reconnue.
En général, la recherche des Salmonella nécessite quatre pha-
L’eau utilisée doit être de l’eau distillée ou déminéralisée, et être
ses successives telles qu’indiquées en 4.1 à 4.4. Voir également
le schéma du mode opératoire dans l’annexe. exempte de substances susceptibles d’inhiber la croissance des
micro-organismes dans les conditions de l’essai.
4.1 Préenrichissement dans un milieu liquide
Lorsque la gélose est spécifiée, la quantité utilisée doit varier
conformément aux instructions du fabricant pour donner des
Ensemencement de la prise d’essai dans le milieu de
milieux d’une fermeté appropriée.
préenrichissement approprié, puis incubation à 37 OC durant 16
à 20 h.
Les mesurages de pH doivent être effectués à l’aide d’un
pH-mètre, ces mesurages se référant à une température de
4.2 Enrichissement dans des milieux liquides
25 OC. Les ajustements éventuels sont faits par addition, soit
sélectifs d’une solution d’acide chlorhydrique à 1 mol/l, soit d’une solu-
tion d’hydroxyde de sodium à 1 mol/l.
Ensemencement d’un milieu au tétrathionate et d’un milieu
sélénite-cystine avec la culture obtenue (4.1). Incubation du Si les milieux de culture préparés et les réactifs ne sont pas utili-
milieu au tétrathionate à 43 OC et incubation du milieu sélénite-
sés extemporanément, ils doivent, sauf spécifications contrai-
cystine à 37 OC durant deux périodes de 18 à 24 h.
res, être conservés à l’obscurité, à une température comprise
1) La gélose au sulfite de bismuth permet de recueillir des souches de Salmonek fermentant le lactose.
1

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ISO 67854985 (FI
5.2.2.2 Solution de thiosulfate de sodium
entre 0 et +5 OC, pendant 1 mois au maximum, dans des con-
ditions qui évitent toute modification de leur composition.
Composition
NOTE - Les systèmes de diagnostic rapide disponibles dans le com-
merce peuvent être utilisés à la place des milieux énumérés en 5.2.7, Thiosulfate de sodium pentahydraté
5.2.8, 5.2.9 et 5.3; voir cependant 9.4.4.
(Na2S203.5HzO)
560 g
100 ml
Eau, quantité suffisante pour
Préparation
5.2 Milieux de culture
Dissoudre le thiosulfate de sodium dans une partie de l’eau.
5.2.1 Milieu préenrichissement: eau peptonée
Compléter au volume final.
tamponnée
Stériliser la solution durant 15 min à 121 + 1 OC.
Composition
5.2.2.3 Solution d’iode
Peptone lO,O g
Chlorure de sodium
5,o g
Composition
Hydrogéno-orthophosphate disodique
dodécahydraté (Na2HP0,. 12H20) w 9
Iode 2w g
Dihydrogéno-orthophosphate de potassium
Iodure de potassium 25,o g
KH2P0,) 115 g
100 ml
Eau, quantité suffisante pour
1 000 ml
Eau
Préparation
Préparation
Dissoudre l’iodure de potassium dans un petit volume d’eau
Dissoudre les composants dans l’eau en portant à ébullition.
et ajouter l’iode.
Ajuster le pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de
Agiter jusqu’à dissolution complète.
7,0 $r 0,l.
Compléter au volume final.
Répartir le milieu, par quantités de 225 ml, dans des flacons
de 500 ml de capacité (ou des multiples de 225 ml dans des
Conserver la solution dans un récipient opaque complète-
flacons de capacité adéquate).
ment fermé.
Stériliser le milieu durant 15 min à 121 + 1 OC.
5.2.2.4 Solution de vert brillant
Composition
52.2 Premier milieu d’enrichissement sélectif:
bouillon au tétrathionate ( Muller-Kauff mann)
Vert brillant
015 g
100 ml
Eau
5.2.2.1 Milieu de base
Préparation
Composition
Ajouter le vert brillant à l’eau.
Extrait de viande 50 9
Conserver la solution au moins une journée à l’obscurité
Peptone
lO,O g
pour permettre l’autostérilisation.
Chlorure de sodium 310 g
Carbonate de calcium
4510 g
1000 ml
Eau
5.2.2.5 Solution de bile de boeuf
Composition
Préparation
10,o g
Bile de boeuf desséchée
Ajouter les composants de base déshydratés ou le milieu de
100 ml
Eau
base complet déshydraté à l’eau, en portant et maintenant à
ébullition jusqu’à dissolution complète des composants
Préparation
solubles.
Dissoudre la bile de boeuf desséchée dans l’eau en portant à
Ajuster le pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de
ébullition.
7,0 zk 0,l.
Stériliser la solution durant 15 min à 121 + 1 OC.
Stériliser le milieu de base durant 15 min à 121 + 1 OC.
2

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60 67854985 (FI
5.2.2.6 Milieu complet Préparation
Compléter à 100 ml avec de l’eau stérile dans une fiole
Composition
stérile.
900 ml
Milieu de base (5.2.2.1)
Ne pas stériliser à l’autoclave
Solution de thiosulfate de sodium (5.2.2.2) 100 ml
Solution d’iode (5.2.2.3) 20 ml
Solution de vert brillant (5.2.2.4) 2 ml 5.2.3.3 Milieu complet
Solution de bile de boeuf (5.2.2.5) 50 ml
Refroidir le milieu de base et ajouter stérilement la solution de
L-cystine à raison de 0,l ml pour 10 ml de milieu de base.
Prépara tion
Ajuster le pH, si nécessaire, à 7,0 k 0,l.
Ajouter stérilement au milieu de base les autres composants
dans l’ordre donné ci-dessus.
Ne pas stériliser à l’autoclave.
Bien mélanger les liquides aprés chaque addition.
Répartir stérilement le milieu, par quantités nécessaires pour
l’essai, dans des flacons stériles de capacité adéquate.
Répartir stérilement le milieu complet, par quantités de
100 ml, dans des flacons stériles de 500 ml de capacité.
Utiliser le milieu le jour même de sa préparation.
Conserver à O-5 OC à l’obscurité mais utiliser dans la
semaine qui suit la préparation. 5.2.4 Premier milieu d’identification: gelose au rouge
de phénol et au vert brillant (Edel & Kampelmacher)
5.2.3 Deuxième milieu d’enrichissement selectif :
5.2.4.1 Milieu de base
bouillon au sélénite-cystine
Composition
AVERTISSEMENT - II convient d’être très prudent lors
de l’utilisation en laboratoire de solutions de sélénite en
Extrait de viande en poudre
510 g
raison de leur effet toxique potentiel. En âucun cas, il ne
Peptone no g
faut pipetter avec la bouche.
Extrait de levure en poudre
3,O g
Hydrogéno-orthophosphate disodique
5.2.3.1 Milieu de base
(Na2HPO,J l,O g
Dihydrogéno-orthophosphate de sodium
( NaH2P04) Of6 g
Composition
Agar-agar 12,0 à 18,0 g 1)
Eau 900 ml
Tryptone
50 g
Lactose
4,o g
Préparation
Hydrogéno-orthophosphate disodique (Na2HP04)
lO,O g
Hydrogénosélénite de sodium
4,o g
Dissoudre les composants de base déshydratés ou le milieu
1 000 ml
Eau
\
de base complet déshydraté dans l’eau, en portant à ébulli-
tion.
Préparation
Ajuster le pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de
Dissoudre les trois premiers ingrédients dans l’eau en por-
7,0 + 0,l.
tant et maintenant à ébullition durant 5 min. Après refroidis-
sement ajouter I’hydrogénosélénite de sodium.
Répartir le milieu de base dans des de
500 ml de capacité maximale.
Ajuster le pH à 7,0 It 0,l.
Stériliser durant 15 min à 121 + 1 OC.
Ne pas stériliser à l’autoclave.
5.2.4.2 Solution de sucres au rouge de phénol
5.2.3.2 Solution de L-cystine
Composition
Composition
10,o g
Lactose
L-cystine Saccharose no g
Cl g
Hydroxyde de sodium, solution,
Rouge de phénol o,a g
100 ml
c(NaOH) = 1 mol/1 15 ml Eau, quantité suffisante pour
Se conformer aux instructions du fabricant.
1)

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IsO 6785-1985 (FI
Refroidir entre 45 et 50 OC en agitant doucement le précipité
Préparation
en suspension.
Dissoudre les ingrédients dans l’eau.
Ne pas stériliser le milieu.
Chauffer au bain d’eau durant 20 min à 70 OC.
Répartir le milieu, par quantités de 20 ml, dans des boîtes de
Petri stériles (de 90 mm de diamètre) et laisser se solidifier.
Refroidir à 55 OC et utiliser immédiatement.
Juste avant l’emploi, sécher soigneusement les boîtes de
5.2.4.3 Milieu complet
milieu gélosé, de préférence après avoir retiré les couvercles
et retourné les boîtes, dans une étuve ou un incubateur
Composition
réglé à 50 + 5 OC durant 30 min.
900 ml
Milieu de base (5.2.4.1)
Utiliser les boîtes séchées entre 24 et 48 h après leur prépa-
100 ml
Solution de sucres au rouge de phénol (5.2.4.2)
ration. Les conserver à l’obscurité.
1 ml
Solution de vert brillant (5.2.2.4)
5.2.6 G&lose nutritive
Préparation
Composition
la solution
Ajouter stérilement la solution de vert brillant à
de phénol refroidie à 55 OC.
de sucres au rouge
Extrait de viande 310 g
Peptone 510 g
maintenu à 50-55 OC et
Ajouter a u milieu de base fondu et
Agar-agar 12,0 g
mélanger
1 000 ml
Eau
5.2.4.4 Préparation des boîtes
Préparation
Répartir le milieu complet refroidi à 45 OC, par quantités d’envi-
Dissoudre les composants déshydratés du milieu ou le
ron 15 ml, dans des boîtes de Petri stériles de 90 mm de diamè-
milieu complet déshydraté dans l’eau, en portant à ébulli-
tre et laisser se solidifier.
tion.
Juste avant l’emploi, sécher soigneusement les boîtes de milieu Ajuster le pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de
gélosé, de préférence après avoir retiré les couvercles et 7,0 + 0,l.
retourné les boîtes, dans une étuve ou un incubateur réglé à
Répartir le milieu de culture dans des tubes ou des flacons
50 I!I 5 OC durant 30 min.
stériles de 500 ml de capacité maximale.
Les boîtes de milieu gélosé non séchées ne doivent pas être
Stériliser le milieu durant 20 min à 121 + 1 OC.
conservées plus de 4 h à la température du laboratoire ou plus
de 24 h à O-5 OC.
Préparation des boîtes de gélose nutritive
5.2.5 Second milieu d’identification : gélose au sulfite
Verser environ 15 ml du milieu fondu dans des boîtes de
de bismuth
Petri stériles (de 90 mm de diamètre) et procéder comme
spécifié en 5.2.4.4.
Composition
Peptone lOtO g 5.2.7 Gélose au citrate de fer et aux trois sucres
Extrait de boeuf 5,O g (gélose TSI)
Glucose 5,O g
Hydrogéno-orthophosphate disodique 4,o g Composition
Sulfate de fer( I 1) 013 9
Extrait de viande 3,O cl
Citrate de bismuth ammoniacaIl) 1,35 g
Extrait de levure 310 $3
Sulfite de sodium 1) 615 g
Peptone 20,o g
Agar-agar mo g
Chlorure de sodium 5,O g
0,025 g
Vert brillant
Lactose lO,O $3
1 000 ml
Eau
10,o g
Saccharose
Glucose LO g
Préparation
Citrate de ferI II 1) 03 g
Thiosulfate de sodium 0,3 g
dre les ingrédients dans l’eau, en portant à ébullition
Dissou
0,024 g
Rouge de phénol
durant environ 1 min.
Agar-agar 12,o g
Eau 1000 ml
Ajuster le pH à 7,7 k 0,l.
1) Au lieu de ces composants, 8 g d’indicateur au sulfite de bismuth TBi(SO,),l peuvent être utilisés.
4

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ISO 67854985 (FI
5.2.8.3 Milieu complet
Préparation
Composition
Dissoudre les composants du milieu déshydratés ou le
milieu complet déshydraté dans l’eau, en portant à ébulli-
Milieu de base (5.2.8.1) 950 ml
tion.
Solution d’urée (5.2.8.2) 50 ml
Ajuster le pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de
Préparation
7,4 + 0,l.
Ajouter stérilement la solution d’urée au milieu de base préa-
Répartir le milieu, par quantités de 10 ml, dans des tubes de
lablement fondu puis refroidi à 45 OC.
17 à 18 mm de diamètre.
Répartir le milieu complet, par quantités de 10 ml, dans des
Stériliser le milieu durant 10 min à 121 + 1 OC.
tubes stériles.
n
en position inclinée de facon à obtenir u
Laisser reposer
Laisser reposer en position inclinée.
4 à 5 cm.
culot de 2,5 cm de profondeur et une pente de
5.2.9 Milieu de décarboxylation à la lysine
Composition
(Christensen)
5.2.8 Gélose pour la recherche à I’uréase
Monohydrochlorure de L-lysine 510 g
Extrait de levure
310 g
5.2.8.1 Milieu de base
Glucose l,O g
Pourpre de bromocrésol 0,015 g
Composition
Eau 1 000 ml
Peptone w g Préparation
Glucose
w g
Chlorure de sodium Dissoudre les composants dans l’eau, en portant à ébulli-
510 9
Dihydrogéno-orthophosphate de potassium tion.
KH2P04) 2,o g
0,012 g
Rouge de phénol Ajuster le pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de
Agar-agar 15,O g 6,8 + 0,l.
Eau 1 000 ml
Répartir le milieu, par quantités de 5 ml, dans des tubes de
culture d’environ 8 mm de diamètre et 160 mm de longueur.
Préparation
Stériliser le milieu durant 10 min à 121 + 1 OC.
Dissoudre les composants de base déshydratés ou le milieu
de base complet déshydraté dans l’eau, en portant à ébulli-
tion.
5.3 Réactifs
Ajuster le pH si nécessaire, de sorte qu’après stérilisation, il
soit de 6,8 k 0,l.
5.3.1 Solution saline
Stériliser le milieu de base durant 15 min à 121 + 1 OC.
Composition
Chlorure de sodium
8,5 g
5.2.8.2 Solution d’urée
1000 ml
Eau
Composition
Préparation
Urée
4wl
Dissoudre le chlorure de sodium dans l’eau, en portant à
Eau, quantité suffisante pour 1 000 ml
ébullition.
Ajuster le pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de
Préparation
7,0 z!l 0,l. .
Dissoudre l’urée dans l’eau.
Répartir la solution dans des flacons ou dans des tubes, de
sorte qu’après stérilisation, ils contiennent 90 à 100 ml de
Stériliser par filtration et contrôler la stérilité. (Pour les
solution.
détails relatifs à la technique de stérilisation par filtration,
faire référence à tout manuel approprié de microbiologie.)
Stériliser la solution durant 15 min à 121 + 1 OC.
. 5

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ISO 67854985 (FI
Préparation
5.3.2 Réactifs pour la recherche de P-galactosidase 1)
Dissoudre les composants dans l’eau.
5.3.2.1 Toluène
Ajuster le pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de
6,9 + 0,l.
5.3.2.2 Solution tampon
Répartir 3 ml de milieu dans chacun des tubes.
Composition
Stériliser le milieu durant 15 min au maximum, à
Dihydrogéno-orthophosphate de sodium
121 + 1 OC.
6,9 g
(NaH2P04)
Hydroxyde de sodium,
3 ml (environ)
solution à environ 0,l mol/1
5.3.3.2 Solution de créatine
50 ml
Eau, quantité suffisante pour
Composition
Préparation
015 g
Créatine monohydratée UV-amidinosarcosine)
Dissoudre le dihydrogéno-orthophosphate de sodium dans 100 ml
Eau
environ 45 ml d’eau.
Préparation
Ajuster le pH à 7,0 + 0,l avec environ 3 ml de la solution
d’hydroxyde de sodium.
Dissoudre la créatine monohydratée dans l’eau.
Compléter à 50 ml avec de l’eau.
5.3.3.3 Solution éthanolique de naphtol-1
5.3.2.3 Solution d’ONPG
Composition
Composition
Naphtol-1 6!3
100 ml
Éthanol, à 96 % (Vl v)
Orthonitrophényl-P-D-galactopyranoside (ONPG) 08 g
15 ml
Eau
Prépara tion
Préparation
Dissoudre le naphtol-1 dans I’éthanol.
Dissoudre I’ONPG dans l’eau à 50 OC.
5.3.3.4 Solution d’hydroxyde de potassium
Refroidir la solution.
Composition
5.3.2.4 Réactif complet
Hydroxyde de potassium WI
100 ml
Eau
Composition
Préparation
5 ml
Solution tampon (5.3.2.2)
15 ml
Solution d’ONPG (5.3.2.3)
Dissoudre l’hydroxyde de potassium dans l’eau.
Préparation
5.3.4 Réactifs pour la réaction de I’indole
Ajouter la solution tampon à la solution d’ONPG
5.3.4.1 Milieu tryptone-tryptophane (de Ljutov)
Voges- Proska
ur la réaction de
5.3.3 Réactifs
PO
(méthode rapide de Barry et Feeney)
Composition
Tryptone 10 g
5.3.3.1 Milieu VP
Chlorure de sodium 5g
DL-Tryptophane lg
Composition
1000 ml
Eau
TO g
Peptone
Préparation
Glucose 5s) g
Hydrogéno-orthophosphate dipotassique
Dissoudre les composants dans l’eau, en portant à ébulli-
50 g
K,HP04)
1 000 ml tion, et filtrer.
Eau
1) Un disque imprégné de P-galactosidase disponible dans le commerce peut être utilisé.
6

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ISO 67854985 (F)
sérums préparés par un fournisseur dont la compétence est
Ajuster le pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de
reconnue (par exemple, un organisme gouvernemental appro-
7,5 * 0,l.
. II
prié).
Répartir 5 ml de milieu dans chacun des tubes.
Stériliser le milieu durant 15 min à 121 + 1 OC.
6 Appareillage et verrerie
5.3.4.2 Réactif de Kovacs
Matériel courant de laboratoire de microbiologie, et notam-
ment :
Composition
Diméthylamino-4 benzaldéhyde
5g
6.1 Appareillage
25 ml
Acide chlorhydrique, Q 1,18 à 1,19 g/ml
75 ml
Méthyl-2 butanol-
6.1.1 Appareils pour la stérilisation en chaleur sèche
Préparation (four) ou en chaleur humide (autoclave).
Mélanger les composants. Le matériel en contact avec les milieux de culture, le diluant et
l’échantillon, sauf s’il est livré stérile (particulièrement celui en
plastique), doit être stérilisé
5.3.5 Gélose nutritive semi-solide
-
soitau four en le maintenant à une température comprise
Composition
entre 170 et 175 OC durant au moins 1 h;
Extrait de viande
3,O g
-
soit à l’autoclave en le maintenant à une température de
Peptone 5,O g
121 + 1 OC durant au moins 20 min.
Agar-agar 4à9 g’)
1000 ml
Eau
Un autoclave est également nécessaire pour la stérilisation des
milieux de culture et des réactifs. II doit être réglable à
Préparation
121 + 1 OC et à 115 + 1 OC.
Dissoudre les composants de déshyd l’eau,
en portant à ébullition.
6.1.2 Enceinte de séchage, étuve ou incubateur,
ventilé(e) (permettant de sécher la surface des milieux gélosés
Ajuster le pH de sorte qu’après stérilisation, il soit de
coulés en boîte), réglable à 50 + 5 OC.
7,0 * 0,l.
flacons de 500 ml de capacité
Répartir le milieu
6.1.3 Incubateur, réglable à 37 + 1 OC.
maximale.
Stériliser le milieu durant 15 min à 121 I!I 1 OC. 6.1.4 Incubateur, réglable à 43 k 0,5 OC.
Préparation des boîtes de gélose
6.1.5 Bains d’eau, réglables à 45 + 1 OC et à 37 + 1 OC.
Répartir le milieu complet, récemment préparé, dans des
boîtes de Petri (de 90 mm de diamètre) par quantités d’envi-
6.1.6 Homogénéisateurs
ron 15 ml. Les boîtes ne doivent pas être séchées.
L’un des appareils suivants doit être utilisé:
5.4 Sérums
a) homogénéisateur rotatif, fonctionnant à une fré-
quence de rotation comprise entre 8 000 et 45 000 min -1,
On peut trouver dans le commerce plusieurs sérums anti-Sal-
avec des récipients en verre ou en métal, munis de préfé-
monella c’est-à-dire des anti-sérums contenant un ou plusieurs
rence de couvercles et résistant aux conditions de stérilisa-
groupes ((0)) (dénommés anti-sérums 0 monovalents ou poly-
tion;
valents), des anti-sérums Vi et des anti-sérums contenant des
anticorps pour un ou plusieurs facteurs «H» (dénommés anti-
b) homogénéisateur de type péristaltique, avec des
sérums H monovalents ou polyvalents). Pour chaque sérum,
sacs en plastique stériles.
suivre les instructions d’utilisation données par le fabricant.
NOTE - Les récipients ou les sacs en plastique doivent être de capa-
Tous les’essais devront être faits afin de s’assurer que les anti-
cité suffisante pour permettre le mélange correct de l’échantillon pour
sérums utilisés conviennent pour la recherche de tous les séro-
essai avec le diluant. En général, le volume du récipient doit être égal à
types de SalmoneRa. Dans ce but on pourra se servir d’anti-
environ deux fois le volume de l’échantillon et du diluant.
1) Se conformer aux instructions du fabricant.
7

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ISO 67854985 (FI
6.1.7 Anses bouclées, en platine iridié ou en nickel- chrome, organismes, en inversant rapidement 25 fois le récipient avec
d’environ 3 mm de diamètre. l’échantillon. II faut éviter la formation de mousse ou bien la
laisser se disperser. L’intervalle entre le mélange et le prélève-
ment de l’échantillon pour essai ne doit pas dépasser 3 min.
82 . Lait sec, poudre de lactosé rum, ba
aséine
en poudre, lactose, c
6.1.9 Réfrigérateur (permettant de conserver les milieux et
Mélanger soigneusement le contenu du récipient fermé, en
réactifs préparés), réglable à O-5 OC.
secouant manuellement et en inversant de facon répétée. Si le
récipient est trop rempli pour permettre une agitation vigou-
6.2 Verrerie
reuse, prendre un récipient plus grand. Mélanger.
La verrerie doit pouvoir résister à des stérilisations répétées.
8.3 Beurre
6.2.1 Flacons de CU lture 1) pour la stérilisation et la conser-
f
Faire fondre l’échantillon dans un récipient stérile dans un bain
milieux liqui-
vation des milieux de culture et l’incubation des
d’eau maintenu à 45 + 1 OC (6.1.5). Agiter lorsqu’on fait fon-
des.
dre et retirer le récipient immédiatement du bain d’eau lorsque
l’échantillon vient d’être fondu.
6.2.2 Tubes de culture, de 8 mm de diamètre et 160 mm de
longueur, pour le milieu de décarboxylation à la lysine.
8.4 Fromage
6.2.3 Éprouvettes graduées, pour la préparation des milieux
Habituellement, l’échantillon pour laboratoire (prélevé confor-
complets.
mément à I’ISO 707) constituera l’échantillon pour essai. Pro-
céder alors comme décrit en 9.1.5.
6.2.4 Pipettes graduées, de 25, 10 et 1 ml de capacités
nominales, graduées respectivement en 0,5, Of5 et Of1 ml.
85 . Glaces de consommation
Procéder comme dans le cas du beurre (8.3), mais en utilisant
6.2.5 Boîtes de Petri, comme suit:
un bain d’eau maintenu au maximum à 37 OC (6.1.51, du fait
que l’échantillon ne doit pas dépasser cette température.
diamétre extérieur 90*2mm
18 mm
hauteur extérieure, minimum
.
86 Lait fermenté, yaourt, crèmes, desserts
Le bord doit être rodé dans un plan parallèle à la base.
Mélanger le contenu du récipient fermé, en secouant manuelle-
Le fond de la boîte doit être plat et parallèle à la base.
ment et en inversant de facon répétée, ou ouvrir le récipient et
mélanger le contenu stérilement à l’aide d’une spatule ou d’une
Couvercle, muni d’un rebord
cuillère stérile.
102 mm
diamétre extérieur, maximum
être utili-
NOTE - Des boîtes de Petri en plastique peuvent également
9 Mode opératoire
sées, même si leurs dimensions sont légèrement différentes.
Voir les mesures de sécurité au chapitre 12.
7 Échantillonnage
91 . Prise d’essai et préenrichissement
Voir ISO 707.
Introduire la prise d’essai dans le milieu de préenrichissement et
Suivre les instructions d’échantillonnage pour des analyses opérer comme décrit en 9.1 .l à 9.1.7.
microbiologiques.
nrichis-
Pour une récapitulation des modes opératoires de prée
se reporter au tableau 1.
sement et d’enrichissement,
8 Préparation de l’échantillon pour essai
9.1 .l Lait
8.1 Lait
Un préenrichissement n’est pas nécessaire. Se reporter à 9.2,
Agiter vigoureusement l’échantillon pour essai afin d’ assurer en utilisant 25 ml de l’échantillon pour essai et 225 ml du milieu
uniforme que possible des micro- d’enrichissement, respectivement.
une répartition aussi
Des flacons à capsule métallique à vis peuvent être utilisés.
1)
8

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ISO 67854985 (FI
9.1.2 Lait sec soudre ou disperser dans 2,25 litres de milieu de préenrichissement; ou
bien encore on peut réunir les portions de 10 ml de milieu de préenri-
chissement provenant des 10 prises d’essai séparées pour enrichir
Préparer un flacon bouché contenant 225 ml d’eau distillée
1 litre de milieu d’enrichissement sélectif.
stérile et 1 ml de la solution de vert brillant (5.2.2.4). Peser
stérilement 25 g de l’échantillon pour essai et le verser à la
2 Sauf spécification contraire, contrôler le pH de la suspension et
surface du liquide dans le flacon. Boucher le flacon, mais ne l’ajuster, si nécessaire, à 6,8.
pas l’agiter. Laisser reposer à la température ambiante durant
60 + 10 min avant incubation. L’ajustement du pH n’est pas
9.1.9 Incubation
nécessaire. Si après 3 h d’incubation, le lait sec n’est pas
encore dissous, mélanger le contenu du flacon par agitation.
Incuber les flacons préparés conformément de 9.1.2 à 9.1.8, à
37 OC durant 16 à 20 h.
9.1.3 Lait sec, babeurre sec
Peser stérilement 25 g de l’échantillon pour essai dans un fla-
9.2 Enrichissement
con bouché contenant 225 ml d’eau distillée stérile. Agiter
jusqu’à dissolution et ajouter 1 ml de la solution de vert brillant
9.2.1 Transférer, à l’aide d’une pipette, 10 ml du milieu de
(5.2.2.4).
préenrichissement incubé (9.1) dans un flacon contenant
100 ml du milieu d’enrichissement sélectif au tétrathionate
9.1.4 Lactose
(5.2.2); transférer de même 10 ml du milieu de préenrichisse-
ment incubé dans un flacon contenant 100 ml de sélénite-
Peser stérilement 25 g de l’échantillon pour essai dans un fla-
cystine (5.2.3).
con bouché contenant 225 ml du milieu de préenrichissement
(5.2.1) et agiter jusqu’à dissolution.
Dans le cas du lait, transférer stérilement 25 ml de l’échantillon
pour essai dans 225 ml du milieu au tétrathionate (5.2.21, et
également 25 ml dans 225 ml du milieu au sélénite-cystine
9.1.5 Caséine, fromage
(5.2.3).
Peser stérilement 25 g de l’échantillon pour essai dans le réci-
pient stérile d’un homogénéisateur à grande vitesse ou de type
9.2.2 Incuber le milieu au tétrathionate inoculé durant 18
péristaltique (6.1.6) et ajouter 225 ml du milieu de préenrichis-
à 24 h à 43 + Of5 OC, et le milieu au sélénite-cystine inoculé
sement (5.2.1) à 45 OC. Mélanger jusqu’à ce que la prise d’essai
durant 18 à 24 h à 37 k 1 OC.
soit totalement dispersée (1 à 3 min). SIassurer que la tempéra-
ture de dispersion ne dépasse pas 45 OC.
9.3 Ensemencement et identification
9.1.6 Beurre
9.3.1 Ensemencer avec une anse, à partir de la culture de cha-
Agiter l’échantillon pour essai fondu et, à l’aide d’une pipette,
que milieu d’enrichissement, la surface d’une boîte de gélose au
portée à environ 45 OC, en introduire 25 ml dans un flacon con-
vert brillant et au rouge de phénol (5.2.4) et d’une boîte de
tenant 225 ml du milieu de préenrichissement (5.2.1). Mélan-
gélose au sulfite de bismuth (5.2.5), de facon à permettre le
ger.
développement de colonies bien isolées. Remettre les milieux
d’enrichissement en incubation (voir 9.3.3).
.7 Produits laitiers congelés (y compris glaces
9.1
de consommation)
9.3.2 Incuber les boîtes (retournées) à 37 + 1 OC durant 20 à
24 h.
Introduire,
...