ISO 18744:2016

DRAFT INTERNATIONAL STANDARD
ISO/DIS 18744
ISO/TC 34/SC 9 Secretariat: AFNOR
Voting begins on: Voting terminates on:
2013-11-07 2014-04-07
Microbiology of the food chain — Detection and
enumeration of Cryptosporidium and Giardia in fresh leafy
green vegetables and berry fruits
Microbiologie de la châine alimentaire — Recherche et dénombrement des Cryptosporidium et Giardia
dans les légumes verts frais à feuilles et les fruits à baies
ICS: 07.100.30
ISO/CEN PARALLEL PROCESSING
This draft has been developed within the International Organization for
Standardization (ISO), and processed under the ISO lead mode of collaboration
as defined in the Vienna Agreement.
This draft is hereby submitted to the ISO member bodies and to the CEN member
bodies for a parallel five month enquiry.
Should this draft be accepted, a final draft, established on the basis of comments
received, will be submitted to a parallel two-month approval vote in ISO and
THIS DOCUMENT IS A DRAFT CIRCULATED
formal vote in CEN.
FOR COMMENT AND APPROVAL. IT IS
THEREFORE SUBJECT TO CHANGE AND MAY
NOT BE REFERRED TO AS AN INTERNATIONAL
STANDARD UNTIL PUBLISHED AS SUCH.
To expedite distribution, this document is circulated as received from the
IN ADDITION TO THEIR EVALUATION AS
committee secretariat. ISO Central Secretariat work of editing and text
BEING ACCEPTABLE FOR INDUSTRIAL,
composition will be undertaken at publication stage.
TECHNOLOGICAL, COMMERCIAL AND
USER PURPOSES, DRAFT INTERNATIONAL
STANDARDS MAY ON OCCASION HAVE TO
BE CONSIDERED IN THE LIGHT OF THEIR
POTENTIAL TO BECOME STANDARDS TO
WHICH REFERENCE MAY BE MADE IN
Reference number
NATIONAL REGULATIONS.
ISO/DIS 18744:2013(E)
RECIPIENTS OF THIS DRAFT ARE INVITED
TO SUBMIT, WITH THEIR COMMENTS,
NOTIFICATION OF ANY RELEVANT PATENT
RIGHTS OF WHICH THEY ARE AWARE AND TO
©
PROVIDE SUPPORTING DOCUMENTATION. ISO 2013

---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO/DIS 18744:2013(E)

Copyright notice
This ISO document is a Draft International Standard and is copyright-protected by ISO. Except as
permitted under the applicable laws of the user’s country, neither this ISO draft nor any extract
from it may be reproduced, stored in a retrieval system or transmitted in any form or by any means,
electronic, photocopying, recording or otherwise, without prior written permission being secured.
Requests for permission to reproduce should be addressed to either ISO at the address below or ISO’s
member body in the country of the requester.
ISO copyright office
Case postale 56 • CH-1211 Geneva 20
Tel. + 41 22 749 01 11
Fax + 41 22 749 09 47
E-mail copyright@iso.org
Web www.iso.org
Reproduction may be subject to royalty payments or a licensing agreement.
Violators may be prosecuted.
ii © ISO 2013 – All rights reserved

---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO/DIS 18744
Contents Page
Foreword . iv
Introduction . v
1 Scope . 1
2 Normative references . 1
3 Terms and definitions . 1
4 Principle. 2
5 Reagents. 2
6 Apparatus . 4
7 Sampling and transport . 5
7.1 Sampling. 5
7.2 Transport . 5
7.3 Receipt of samples . 5
7.4 Storage . 5
7.5 Preparation of test sample . 5
8 Procedure . 5
8.1 Removal of parasites from leafy green vegetables . 5
8.2 Removal of parasites from berry fruits . 6
9 Immunomagnetic separation (IMS) . 7
10 Sample staining . 8
11 Microscopy . 9
11.1 General comments . 9
11.2 Examination of sample preparations using epifluorescence microscopy . 9
11.3 Examination of sample preparations using DIC microscopy . 12
12 Quality control procedures. 13
12.1 General . 13
12.2 Inclusion and interpretation of controls . 13
12.3 Equipment cleaning . 14
13 Reporting of results . 14
13.1 Expression of results . 14
13.2 Test report . 14
Annex A (normative) Preparation of reagents . 16
A.1 General reagents . 16
A.2 Reagents for elution of parasites from fresh produce . 16
A.3 Reagents used in concentration, fixing, staining, detection and QC . 16
Annex B (normative) Preparation of positive process control suspensions . 18
B.1 General . 18
B.2 Determination of the concentration of oocysts or cysts in a stock suspension . 18
B.3 Performance data for the positive control suspensions . 18
Annex C (informative) Percentage recoveries achieved by the methods . 20
Bibliography . 21

© ISO 2013 – All rights reserved iii

---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO/DIS 18744
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 18744 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9,
Microbiology in collaboration with the European Committee for Standardization (CEN) Technical Committee
CEN/TC 275, Food analysis — Horizontal methods in accordance with the Agreement on technical
cooperation between ISO and CEN (Vienna Agreement).
iv © ISO 2013 – All rights reserved

---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO/DIS 18744
Introduction
Cryptosporidium spp. and Giardia duodenalis (syn. G. lamblia, G. intestinalis) are protozoan parasites that can
cause enteric illness in humans. Both organisms are characterized by a robust transmission stage,
Cryptosporidium oocyst and Giardia cyst, which can survive in moist environments (dehydration is lethal) for
prolonged periods. As these transmission stages, hereafter referred to as (oo)cysts, are highly resistant to
chemical and physical pressures, chlorine at the concentrations used in the treatment of drinking
waters,disinfectants used for produce. , the absence of vegetative bacteria on fresh produce as indicators of
faecal contamination does not necessarily indicate the absence of (oo)cysts. No practical method exists to
culture these agents for the purpose of detection, and therefore direct removal from the food sample must be
performed, followed by visualisation of the (oo)cysts by microscopy. The methods described in this document
are for determining whether Cryptosporidium and/or Giardia (oo)cysts are present on the surfaces of fresh
produce, and for their enumeration. This standard is based on the only published methods which have been
tested in a multicenter collaborative trial. Alternative methods can be used following a demonstration of their
equivalence with this standard following the protocol described in ISO 16140.
© ISO 2013 – All rights reserved v

---------------------- Page: 5 ----------------------
DRAFT INTERNATIONAL STANDARD ISO/DIS 18744

Microbiology of the food chain — Detection and enumeration of
Cryptosporidium and Giardia in fresh leafy green vegetables
and berry fruits
1 Scope
This International Standard specifies a method that is applicable for the detection and enumeration of
Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts on or in food products that are described herein as fresh leafy
green vegetables and berry fruits. With suitable controls, it may also be applicable for the examination of other
fresh produce.
The microscopy descriptions are for Cryptosporidium spp. oocysts and Giardia duodenalis cysts of size
ranges which include those species or assemblages known to be pathogenic to humans.
This method is not applicable for the determination of the species or genotypes/assemblages of
Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts. The method will detect all species and genotypes / assemblages
that are known to be pathogenic for humans and also others that are not. For further identification, molecular
typing assays are required, but these may not be applicable if process positive controls have been spiked into
the samples.
This method does not allow the determination of viability or infectivity of any Cryptosporidium oocysts and
Giardia cysts which may be present.
2 Normative references
The following documents, in whole or in part, are normatively referenced in this document and are
indispensable for its application. For dated references, only the edition cited applies. For undated references,
the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies.
ISO 7218:2007, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for
microbiological examinations.
ISO 16140, Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Protocol for the validation of alternative methods.
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
Cryptosporidium oocysts
transmission stages of Cryptosporidium spp.; their detection is based on reaction with specific anti-
Cryptosporidium antibodies and typical morphological characteristics as described in Section 11 of this
International Standard
3.2
Giardia cysts
transmission stages of Giardia spp.; their detection is based on reaction with specific anti-Giardia antibodies
and typical morphological characteristics as described in 11 of this International Standard
© ISO 2013 – All rights reserved
1

---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO/DIS 18744
3.3
fresh leafy green vegetables
plant leaves eaten as a vegetable, which have not been subjected to any process, except cutting and washing
3.4
fresh berry fruits
derived from a variety of plants having small fruit characterized by a high surface : weight ratio, and which
have not been subjected to any process except washing
3.5
sample process control
(Oo)cysts labelled with specific fluorogenic reporters that may be added in defined numbers to the sample
prior to processing to verify that the method after the elution step is operating efficiently
3.6
positive process control
sample to which (oo)cysts have been added in defined numbers prior to extraction to verify that the method
after the elution step is operating efficiently
3.7
negative process control
equivalent quantity of material to the sample, which is considered to be free of (oo)cysts and processed in the
same manner as the tested sample
4 Principle
The principle of the method is based on removal of the oo(cysts) from the sample by elution procedures,
followed by concentration in the eluate by centrifugation and isolation by immunomagnetic separation (IMS).
Detection of the oo(cysts) is performed by microscopy after labelling with monoclonal antibodies (mAbs)
conjugated to a fluorochrome.
5 Reagents
5.1 Reagents required for eluting oo(cysts) from leafy green vegetables and berry fruits
5.1.1 Glycine buffer, pH 5.5 for leafy green vegetables, (Annex A.2.1)
5.1.2 Glycine buffer, pH 3.5 for berry fruits (Annex A.2.2)
5.2 Reagents used in concentrating, fixing, staining, detection, and quality control
5.2.1 Methanol, analytical grade
5.2.2 Paramagnetic beads, for the isolation of Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts
5.2.3 Hydrochloric acid, 0.1 M (Annex A.3.1)
5.2.4 Sodium hydroxide, 1 M (Annex A.3.2)
5.2.5 Fluorescently-labelled monoclonal antibodies (mAbs) against Cryptosporidium oocysts and
Giardia cysts
5.2.6 Immunofluorescence mounting medium (Annex A.3.3)
5.2.7 4’,6’-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride dihydrate (DAPI), freeze-dried reagent

© ISO 2013 – All rights reserved
2

---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO/DIS 18744
5.2.8 DAPI stock solution (Annex A.3.4)
5.2.9 DAPI working solution (Annex A.3.5)
5.2.10 Phosphate buffered saline (PBS) (Annex A.1.1)
5.2.11 Non-fluorescing immersion oil
5.2.12 Stock suspensions of Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts (Annex B)
© ISO 2013 – All rights reserved
3

---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO/DIS 18744
5.2.13 Suspensions of pre-labelled and enumerated non-viable Cryptosporidium oocysts and Giardia
cysts
The fluorochrome label shall be different to that which is used for the detection of the target organism.
5.2.14 Parasite storage medium (Annex A.3.6; A.3.7)
5.2.15 Deionized water
5.2.16 Fingernail varnish (for sealing coverslips onto slides as necessary)

6 Apparatus
This method requires common microbiological laboratory equipment (see ISO 7218) and in particular the
following:
6.1 Tweezers (for handling fresh produce as necessary)
6.2 Welled slides, with hydrophobic coating, wells capable of accommodating 50 µl volume, and coverslips
of appropriate size
6.3 A paddle (peristaltic) blender and compatible filtered bags
6.4 Swing out centrifuge (to accommodate at least 4 x 50 ml conical centrifuge tubes per run)
6.5 Glass Leighton tubes
6.6 Rotating mixer compatible with the Leighton tubes
6.7 Magnetic clip stand compatible with the Leighton tubes
6.8 Magnetic clip stand for microcentrifuge tubes
6.9 Slide warmer tray, 37 °C to 42 °C incubator, or equivalent slide-drying apparatus
6.10 Humidity chamber (lidded box containing damp absorbent material and that can be kept darkened and
held at the temperature appropriate for the immunofluorescent reagent).
6.11 Aspiration device - vacuum source equipped with liquid trap and pipette, or equivalent.
6.12 Epifluorescence microscope with 20×, 40x objectives and 100x objective immersion lens and a
calibrated eyepiece graticule (reticule). Shall include FITC filter set (blue, 480 nm excitation, 520 nm emission
filter) and DAPI filter set (UV, 375 nm excitation, > 420 nm emission). If sample process controls are used, an
additional filter set suitable for the fluorochrome will be required. Differential interference apparatus (DIC)
optics are advantageous. A photographic recording system attached to the microscope may be pertinent for
recording positive or presumptive events.
6.13 FITC control slide for evaluation of fluorescence intensity and verification of proper performance of the
optical system of the fluorescence microscope.
© ISO 2013 – All rights reserved
4

---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO/DIS 18744
7 Sampling and transport
7.1 Sampling
A procedure for sampling is not specified in this International Standard. See the specific International
Standard dealing with the product concerned. If there is no specific International Standard, it is recommended
that the relevant stakeholders (e.g. competent authorities, regulators, customers) come to an agreement on
this subject.
7.2 Transport
Soft fruit samples and other delicate samples shall be handled carefully during transport to preserve their
physical integrity (see ISO 7218:2007, Subclause 8.2 Transport).
7.3 Receipt of samples
Samples should be assessed for acceptance criteria using appropriate guidance as required within the
purpose of testing. See ISO 7218:2007, Subclause 8.3 Receipt. Fresh leafy green vegetables and berry fruits
shall be regarded as perishable and analysis shall commence as soon as possible after acceptance.
7.4 Storage
Fresh leafy green vegetables and berry fruits may be stored refrigerated (between 4 ºC and 8 ºC), to reduce
sample deterioration (see ISO 7218:2007, Subclause 8.4 Storage).
7.5 Preparation of test sample
The condition of the fresh produce shall be noted before the analytical procedure is commenced.
Test samples shall be at least 25 g.
It is recommended that no more than 100 g of any individual sample is analysed in a single procedure.
When analysing whole leafy green vegetables, such as lettuce heads, it is recommended that a random
selection of leaves from different parts of the plant should be examined.
For samples that are in small units, for example raspberries, the sample shall consist of a random sample of
these units.
8 Procedure
8.1 Removal of parasites from leafy green vegetables
1) Place sample in filtered bag. Avoid excessive handling. Use tweezers if necessary.
It is recommended that each sample is spiked with a sample process control suspension containing a
defined number of pre-labelled and enumerated Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts
following the manufacturer’s instructions. The sample process control suspension should be
pipetted on to the surface of the leaves or berries; this should be done after the sample has been
placed in the processing container. The fluorescent label on the sample process control should differ
from that used to detect the target (oo)cysts. If sample process controls are not used, a positive
process control sample is recommended (12.2). Add 200 ml glycine buffer pH 5.5.
2) Process sample in paddle blender for 30 s at 200 to 300 rpm.
3) Collect eluate into a vessel, ensuring that all the vegetable matter is retained in the filter.
© ISO 2013 – All rights reserved
5

---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO/DIS 18744
4) Squeeze the bag and the filter tightly in order to ensure that all the eluate is removed from the
sample.
5) Transfer the eluate to 50 ml conical-bottomed centrifuge tubes, dividing the eluate equally between
them.
Alternatively, the eluate can be transferred to a single 250 ml conical-bottomed centrifuge bottle, if an
appropriate centrifuge / rotor is available for the subsequent step.
Rinsing the sample following washing may increase recovery efficiencies. After transferring the
eluate from the filter bag, and while the tubes are being centrifuged (see point 7 below), add 10 ml 1
M glycine buffer pH 5.5 to the sample and rinse by manipulating the sample and rinsing water from
outside the bag. After removal of the supernatant from the centrifuged tubes, add the rinsate from
the sample to the tubes. Add a further 10 ml of distilled water to the bag, again manipulate produce
and water from outside the bag, and add rinsate to tubes. Centrifuge as in point 7 below.
6) Centrifuge the eluate at 2 500 x g maximum for 10 min with no braking.

NOTE Centrifugation at 2 500 x g maximum may result in a very compact pellet. A lower speed of 1 100 x g maximum

for 10 min with no braking has been reported to give at least equivalent recoveries of Cryptosporidium oocysts and Giardia
cysts.
7) Remove the supernatant, by using a pipette and vacuum source, ensuring the pellet is not disturbed.
If no pellet is visible, extra care shall be taken to ensure that parasites are not lost during aspiration.
8) Re-suspend the pellet in the residual liquid left in the bottom of each tube and combine the pellets
into a single Leighton tube.
9) Rinse the empty 50 ml conical centrifuge tubes with 1 M glycine buffer pH 5.5 (about 3 ml of 1 M
glycine buffer pH 5.5 transferred from tube to tube shall be sufficient) and transfer the rinsate into the
tube containing the combined pellets. Repeat this process until the volume of suspended pellet in the
tube is 10 ml.
10) Estimate the volume of the final pellet.
If the pellet volume exceeds that recommended by the manufacturer of the IMS test kit, centrifuge the sample
a second time in a tube that permits the pellet volume to be measured accurately. Subdivide the sample into
aliquots for IMS such that each aliquot represents the maximum pellet volume recommended by the
manufacturer and make up each aliquot to 9 ml with deionized water.
NOTE At this point the Leighton tube may be capped, refrigerated, and the process halted for up to 24 h.
8.2 Removal of parasites from berry fruits
1) Place sample in 500 ml lidded container. Avoid excessive handling. Use tweezers if necessary.
It is recommended that each sample is spiked with a sample process control suspension containing a
defined number of pre-labelled and enumerated Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts following
the manufacturer’s instructions. The fluorescent label on the sample process control should differ
from that used to detect the target (oo)cysts. If sample process controls are not used, a positive
process control sample is recommended (12.2) Add 200 ml 1 M glycine pH 3.5.
2) Agitate sample gently for 1 min (e.g. by rolling or slow-speed shaking) to minimize damage to the
sample.
3) Transfer eluate to conical centrifuge tubes. If there is excessive detritus from the sample, pour eluate
through a sieve or through a stomacher bag filter, and collect eluate into conical centrifuge tubes
allowing drainage through the filter for 5 min.
© ISO 2013 – All rights reserved
6

---------------------- Page: 11 ----------------------
ISO/DIS 18744
NOTE The eluate can be transferred to a single 250 ml conical-bottomed centrifuge bottle, if an appropriate
centrifuge / rotor is available for the subsequent step.
4) Rinse container (and sieve or filter and stomacher bag if used in point 4) with 50 ml 1 M glycine pH
3.5.
5) Transfer rinsate into the conical centrifuge tubes.
6) Centrifuge the eluate at 2 500 x g maximum for 10 min with no braking.

NOTE Centrifugation at 2 500 x g maximum may result in a very compact pellet. A lower speed of 1 100 x g maximum

has been reported to give at least equivalent recoveries of Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts.
7) Carefully remove the supernatant, by using a pipette and vacuum source of less than 20 kPa (0.2
bar), ensuring the pellet is not disturbed. If no pellet is visible, extra care must be taken to ensure
that parasites are not lost during aspiration.
8) Re-suspend the pellet in the residual liquid left in the bottom of each tube and combine the pellets
into a single Leighton tube.
9) Rinse the empty 50 ml conical centrifuge tubes with 1 M glycine buffer pH 3.5 (about 3 ml of 1 M
glycine buffer pH 3.5 transferred from tube to tube should be sufficient) and transfer the rinsate into
the tube containing the combined pellets. Repeat this process until the volume of suspended pellet in
the tube is 10 ml.
10) Estimate the volume of the final pellet. If the pellet volume exceeds that recommended by the
manufacturer of the IMS test kit, centrifuge the sample a second time in a tube that permits the pellet
volume to be measured accurately. Subdivide the sample into aliquots for IMS such that each aliquot
represents the maximum pellet volume recommended by the manufacturer and make up each
aliquot to 9 ml with deionized water.
NOTE At this point the Leighton tube may be capped, refrigerated, and the process halted for up to 24 h.
8.3 Immunomagnetic separation (IMS)
This technique involves the mixing of the concentrated sample eluate with paramagnetic beads that are
coated with antibodies to either Cryptosporidium oocysts or Giardia cysts, in a buffered medium that enables
maximum binding. The oocyst-bead complexes and/or cyst-bead complexes are then separated from other
debris in the sample by using a magnet. After separation, the oocysts and cysts are dissociated from the
beads by vigorous agitation under acidic conditions. The oocysts and cysts are transferred in suspension to a
microscope slide, where they are neutralised by the addition of alkali (10), and the magnetisable beads are
discarded.
Additional washing steps may be incorporated in the IMS procedure for samples where there are large
amounts of particulates.
A second separation step may be included at the dissociation stage, by adding a further aliquot of hydrochloric
acid solution to the beads and repeating the dissociation procedure. Either place the suspension from the
second dissociation stage on a second microscope slide containing NaOH or add to the original slide with a
further aliquot of NaOH.
NOTE 1 Detailed instructions of the IMS procedure are not provided in this International Standard because these
instructions are dependent on the kit that is being used.
NOTE 2 The commercial kits currently on the market are specifically designed for water sample concentrates (treated
water or untreated (raw) water which is intended for potable supply, or environmental water samples).
© ISO 2013 – All rights reserved
7

---------------------- Page: 12 ----------------------
ISO/DIS 18744
8.4 Sample staining
1) Use a FITC control slide to ensure that the intensity of the excitation light generated by the lamp is
satisfactory and that the field illumination is uniform.
2) Prepare two separate well slides with positive and negative controls. The positive control shall
consist of a suspension of Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts (Annex B). The negative
control shall consist of filtered deionized water or PBS. Positive and negative controls shall be
included wi
...

NORME ISO
INTERNATIONALE 18744
Première édition
2016-04-01
Microbiologie de la chaîne
alimentaire — Recherche et
dénombrement de Cryptosporidium et
Giardia dans les légumes verts frais à
feuilles et les fruits à baies
Microbiology of the food chain — Detection and enumeration of
Cryptosporidium and Giardia in fresh leafy green vegetables and
berry fruits
Numéro de référence
ISO 18744:2016(F)
©
ISO 2016

---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO 18744:2016(F)

DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2016, Publié en Suisse
Droits de reproduction réservés. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée
sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Ch. de Blandonnet 8 • CP 401
CH-1214 Vernier, Geneva, Switzerland
Tel. +41 22 749 01 11
Fax +41 22 749 09 47
copyright@iso.org
www.iso.org
ii © ISO 2016 – Tous droits réservés

---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO 18744:2016(F)

Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
5 Réactifs . 2
6 Appareillage . 3
7 Échantillonnage et transport . 4
7.1 Échantillonnage . 4
7.2 Transport . 4
7.3 Réception des échantillons . 4
7.4 Conservation . 4
7.5 Préparation de l’échantillon pour essai . 4
8 Mode opératoire. 5
8.1 Récupération des parasites sur des légumes verts à feuilles . 5
8.2 Récupération des parasites sur des fruits à baies . 6
8.3 Séparation immunomagnétique (IMS) . 7
8.4 Coloration de l’échantillon . 7
8.5 Examen au microscope . 8
8.5.1 Commentaires généraux . 8
8.5.2 Examen des préparations d’échantillons au microscope à épifluorescence . 9
8.5.3 Examen des préparations d’échantillons au microscope CID .11
9 Procédures de contrôle qualité .12
9.1 Généralités .12
9.2 Inclusion et interprétation des contrôles .13
9.3 Nettoyage de l’équipement .13
10 Compte-rendu des résultats .13
10.1 Expression des résultats .13
10.2 Rapport d’essai .14
Annexe A (normative) Préparation des réactifs .15
Annexe B (normative) Préparation des suspensions de contrôle de processus positives .17
Annexe C (informative) Pourcentages de rendement obtenus avec les méthodes .19
Bibliographie .21
© ISO 2016 – Tous droits réservés iii

---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO 18744:2016(F)

Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer un
engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à
l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes
de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos —
Informations supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-
comité SC 9, Microbiologie.
iv © ISO 2016 – Tous droits réservés

---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO 18744:2016(F)

Introduction
Cryptosporidium spp. et Giardia duodenalis (syn. G. lamblia, G. intestinalis) sont des parasites protozoaires
pouvant causer des maladies entériques chez l’homme. Ces organismes sont tous les deux caractérisés
par un stade de transmission résistant, l’oocyste de Cryptosporidium et le kyste de Giardia, qui peuvent
survivre dans des environnements humides pendant de longues périodes. Ces stades de transmission
sont ci-après appelés collectivement (oo)cystes. Les oocystes de Cryptosporidium en particulier sont très
résistants au chlore aux concentrations utilisées dans le traitement de l’eau potable, et la désinfection
chimique des légumes verts à feuilles et fruits à baies, lorsqu’elle est effectuée pendant le traitement,
peut également être inefficace. Par conséquent, l’absence de bactéries végétatives sur les produits frais
en tant qu’indicateurs de contamination fécale, n’est pas forcément synonyme d’absence d’(oo)cystes. Il
n’existe aucune méthode de culture de Cryptosporidium spp. et Giardia duodenalis à des fins de détection
et, par conséquent, pour détecter une contamination par ces parasites, il faut isoler directement les
(oo)cystes sur l’échantillon alimentaire puis les observer au microscope. Les méthodes décrites dans la
présente Norme internationale servent à déterminer si des (oo)cystes de Cryptosporidium et/ou Giardia
sont présents à la surface des produits frais et à les dénombrer. La présente Norme internationale
repose sur les méthodes publiées qui ont été soumises à essai lors d’une étude multicentrique
interlaboratoires. D’autres méthodes peuvent être utilisées s’il est démontré qu’elles sont équivalentes
[1]
à la présente Norme internationale, suivant le protocole décrit dans l’ISO 16140.
© ISO 2016 – Tous droits réservés v

---------------------- Page: 5 ----------------------
NORME INTERNATIONALE ISO 18744:2016(F)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Recherche et
dénombrement de Cryptosporidium et Giardia dans les
légumes verts frais à feuilles et les fruits à baies
AVERTISSEMENT — Il convient que l’utilisateur de la présente Norme internationale connaisse
bien les pratiques courantes de laboratoire. La présente Norme internationale n’a pas pour but de
traiter de tous les problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il incombe
à l’utilisateur de la présente norme d’établir des pratiques appropriées en matière d’hygiène et
de sécurité et de s’assurer de la conformité à la réglementation nationale en vigueur.
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie une méthode applicable à la détection et au dénombrement
des oocystes de Cryptosporidium et aux kystes de Giardia sur ou dans des produits alimentaires qui
sont décrits ici comme étant des légumes verts frais à feuilles et des fruits à baies. Grâce à des contrôles
appropriés, elle peut être également applicable à l’examen d’autres produits frais.
Les descriptions faites au microscope concernent les oocystes de Cryptosporidium spp. et les kystes de
Giardia duodenalis dont la taille inclut les espèces (Cryptosporidium) ou assemblages (Giardia) connus
pour être pathogènes pour l’homme.
Cette méthode n’inclut pas l’analyse moléculaire et n’est donc pas applicable à la détermination des
espèces ou des génotypes/assemblages d’oocystes de Cryptosporidium et de kystes de Giardia. La
méthode permettra de détecter toutes les espèces et tous les génotypes/assemblages connus pour être
pathogènes pour l’homme ainsi que d’autres qui ne le sont pas. Pour mieux les identifier, des essais de
typage moléculaire sont requis. Toutefois, ceux-ci ne peuvent pas être effectués de manière fiable si
des contrôles de processus positifs ont été ajoutés aux échantillons, car le résultat des essais de typage
moléculaire sera erroné.
Cette méthode ne permet pas de déterminer la viabilité ou l’infectivité des oocystes de Cryptosporidium
et des kystes de Giardia qui peuvent être présents.
2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 7218:2007, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et les définitions suivants s’appliquent.
3.1
oocyste de Cryptosporidium
stade de transmission de Cryptosporidium spp.
Note 1 à l’article: Sa détection est basée sur la réaction avec des anticorps anti-Cryptosporidium spécifiques et les
caractéristiques morphologiques décrites dans l’Article 8.
© ISO 2016 – Tous droits réservés 1

---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO 18744:2016(F)

3.2
kyste de Giardia
stade de transmission de Giardia spp.
Note 1 à l’article: Sa détection est basée sur la réaction avec des anticorps anti-Giardia spécifiques et les
caractéristiques morphologiques typiques décrites dans l’Article 8.
3.3
légume vert frais à feuilles
feuilles de plantes consommées comme un légume, qui n’ont été soumises à aucun processus, excepté
peut-être le découpage et le lavage
3.4
fruit frais à baies
petit fruit rond ou oblong, charnu et juteux, qui n’a été soumis à aucun processus excepté peut-être le
découpage et le lavage
3.5
contrôle interne d’extraction
(oo)cystes marqués à l’aide de marqueurs fluorescents spécifiques qui peuvent être ajoutés dans
des quantités définies à l’échantillon avant le traitement pour s’assurer que la méthode fonctionne
correctement
3.6
contrôle positif
échantillon dans lequel des (oo)cystes ont été ajoutés dans des quantités définies avant l’extraction
pour vérifier que la méthode consécutive à l’étape d’élution est efficace
3.7
contrôle négatif
échantillon ayant une quantité de matière équivalente à celle de l’échantillon soumis à essai, qui est
considéré comme étant exempt d’(oo)cystes et traité comme l’échantillon soumis à essai
4 Principe
Le principe de la méthode repose sur la récupération des (oo)cystes de l’échantillon par un mode
opératoire d’élution, suivie d’une concentration dans l’éluat par centrifugation et isolement par
séparation immunomagnétique (IMS). La détection des (oo)cystes est effectuée au microscope après
marquage avec des anticorps monoclonaux (mAbs) spécifiques conjugués à un fluorochrome.
5 Réactifs
5.1 Réactifs requis pour éluer les (oo)cystes des légumes verts à feuilles et des fruits à baies
5.1.1 Tampon glycine, pH 5,5 pour les légumes verts à feuilles (A.2.1).
5.1.2 Tampon glycine, pH 3,5 pour les fruits à baies (A.2.2).
5.2 Réactifs requis pour la concentration, la fixation, la coloration, la détection et le contrôle
qualité
5.2.1 Méthanol, de qualité analytique.
5.2.2 Billes paramagnétiques, couplées à des anticorps spécifiques des parois des oocystes de
Cryptosporidium et/ou des kystes de Giardia.
2 © ISO 2016 – Tous droits réservés

---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO 18744:2016(F)

5.2.3 Acide chlorhydrique (HCl), 0,1 mol/l (A.3.1).
5.2.4 Hydroxyde de sodium (NaOH), 1 mol/l (A.3.2).
5.2.5 Anticorps monoclonaux (mAbs) fluorescents dirigés contre les oocystes de Cryptosporidium
et/ou les kystes de Giardia.
5.2.6 Milieu de montage pour immunofluorescence (A.3.3).
5.2.7 Dichlorhydrate de 4’,6’-diamidino-2-phénylindole dihydraté (DAPI), réactif lyophilisé.
5.2.8 Solution mère de DAPI (A.3.4).
5.2.9 Solution de travail de DAPI (A.3.5).
5.2.10 Tampon phosphate salin (PBS), pH 7,3 (A.1.1).
5.2.11 Huile à immersion non fluorescente.
5.2.12 Suspensions mères d’oocystes de Cryptosporidium et de kystes de Giardia (Annexe B).
5.2.13 Suspensions d’oocystes de Cryptosporidium et de kystes de Giardia non viables
préalablement marqués et dénombrés.
Le marqueur fluorochrome doit être d’une couleur différente de celle utilisée pour détecter
l’organisme cible.
5.2.14 Milieu de conservation des parasites (A.3.6 et A.3.7).
5.2.15 Eau déminéralisée et filtrée (eau ultra-pure de type 1).
5.2.16 Vernis à ongles (pour sceller les lamelles couvre-objet sur les lames, si nécessaire).
6 Appareillage
Cette méthode requiert l’utilisation d’un matériel courant de laboratoire de microbiologie (se référer à
l’ISO 7218), et en particulier, ce qui suit.
6.1 Pinces, pour manipuler les produits frais si nécessaire.
6.2 Mélangeur à pales (péristaltique) et sacs à filtre compatibles.
6.3 Centrifugeuse swing-out (pour recevoir au moins 4 tubes à centrifuger coniques de 50 ml par
cycle).
6.4 Tubes de Leighton en verre.
6.5 Mélangeur rotatif compatible avec les tubes de Leighton.
6.6 Porte-pinces magnétique compatible avec les tubes de Leighton.
6.7 Porte-pinces magnétique pour tubes de microcentrifugeuse.
© ISO 2016 – Tous droits réservés 3

---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO 18744:2016(F)

6.8 Lames à puits, recouvertes d’un revêtement hydrophobe, puits d’une capacité volumique de 50 µl
d’échantillon traité après IMS, et lamelles couvre-objet de taille appropriée.
6.9 Chauffe-lames, incubateur réglé entre 37 °C et 42 °C, ou appareil équivalent de séchage des lames.
6.10 Chambre humide, boîte avec couvercle contenant un matériau absorbant l’humidité, par exemple
une serviette en papier, qui peut être maintenue à la température et à l’humidité appropriées au réactif
immunofluorescent.
6.11 Dispositif d’aspiration, source de vide équipée d’un piège à liquide et d’une pipette, ou équivalent.
6.12 Microscope à épifluorescence équipé d’objectifs 20× et 40× ainsi que d’une lentille à
immersion d’objectif 100× et d’un oculaire (réticule) étalonné. Doit comprendre un ensemble de
filtres adaptés à l’isothyocyanate de fluorescéine (FITC) (excitation de 480 nm, émission de 520 nm) et
un ensemble de filtres DAPI (excitation de 375 nm, émission > 420 nm). En cas d’utilisation de contrôles
internes d’extraction, un autre ensemble de filtres adapté au fluorochrome sera nécessaire. Un système
optique à contraste interférentiel différentiel (CID) est utile. Un système d’enregistrement photographique
fixé au microscope peut être utile pour enregistrer les événements positifs ou présomptifs.
6.13 Lame de contrôle FITC servant à évaluer l’intensité de fluorescence et à vérifier le bon
fonctionnement du système optique du microscope à fluorescence.
7 Échantillonnage et transport
7.1 Échantillonnage
La présente Norme internationale ne spécifie aucun mode opératoire d’échantillonnage. Voir la Norme
internationale spécifique relative au produit concerné. En l’absence de Norme internationale spécifique,
il est recommandé aux parties prenantes concernées (par exemple, autorités compétentes, organismes
de réglementation, clients) de trouver un accord à ce sujet.
7.2 Transport
Les échantillons de fruits mous et autres échantillons délicats doivent être manipulés avec soin pendant
le transport pour préserver leur intégrité physique (se référer à l’ISO 7218:2007, 8.2).
7.3 Réception des échantillons
Il convient d’évaluer les échantillons en fonction de critères d’acceptation basés sur des lignes directrices
appropriées dans le cadre de l’essai (se référer à l’ISO 7218:2007, 8.3). Les légumes verts frais à feuilles
et les fruits à baies doivent être considérés comme étant périssables et être analysés dès que possible
après leur réception. Les critères de rejet peuvent inclure la présence de moisissure, la décomposition
de l’échantillon ou la perte d’intégrité de l’échantillon en cas de fruit à baies.
7.4 Conservation
Les légumes verts frais à feuilles et les fruits à baies peuvent être conservés au réfrigérateur (entre 4 °C
et 8 °C), pour réduire le risque de détérioration des échantillons (se référer à l’ISO 7218:2007, 8.4).
7.5 Préparation de l’échantillon pour essai
L’état des produits frais doit être consigné avant de commencer l’analyse.
Les échantillons pour essai doivent peser au moins 25 g.
4 © ISO 2016 – Tous droits réservés

---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO 18744:2016(F)

Il est recommandé de ne pas analyser plus de 100 g d’échantillon individuel par analyse.
Lors de l’analyse de légumes verts à feuilles entières, par exemple la laitue pommée, il est recommandé
de choisir au hasard des feuilles propres intactes (sans les tiges) provenant de différentes parties de la
plante et de les examiner.
Pour les échantillons sous forme de petites unités, par exemple les framboises, l’échantillon doit être un
échantillon aléatoire de ces unités.
8 Mode opératoire
8.1 Récupération des parasites sur des légumes verts à feuilles
a) Placer l’échantillon dans un sac à filtre. Éviter toute manipulation inutile. Utiliser des pinces au besoin.
Il est recommandé d’ajouter à chaque échantillon une suspension de contrôles internes d’extraction
contenant une quantité définie d’oocystes de Cryptosporidium et/ou de kystes de Giardia
préalablement marqués et dénombrés, conformément aux instructions du fabricant. Il convient de
déposer la suspension de contrôles sur la surface des feuilles, après avoir placé l’échantillon dans
le récipient de traitement. Il convient que le marqueur fluorescent présent dans le contrôle interne
d’extraction soit différent de celui utilisé pour détecter les (oo)cystes cibles dans les échantillons
pour essai. Si aucun contrôle interne d’extraction n’est utilisé, il est recommandé d’employer un
contrôle de processus positif (voir en 9.2).
b) Ajouter 200 ml de tampon glycine pH 5,5.
c) Placer pendant 30 s l’échantillon dans un mélangeur à pales tournant entre 200 tr/min et 300 tr/min.
d) Recueillir l’éluat dans des tubes à centrifuger à fond conique de 50 ml, en y répartissant l’éluat en
quantités égales et en s’assurant que toute la matière végétale est retenue dans le filtre. Appuyer
fermement sur le sac et sur le filtre pour s’assurer que tout l’éluat est extrait de l’échantillon. L’éluat
peut être recueilli dans un récipient avant de le transvaser dans des tubes à centrifuger.
L’éluat peut aussi être transvasé dans un flacon à centrifuger à fond conique de 250 ml, si une
centrifugeuse/un rotor approprié(e) est disponible pour l’étape suivante.
Rincer l’échantillon après lavage peut accroître le rendement. Après avoir transvasé l’éluat depuis
le sac à filtre, tout en centrifugeant les tubes [voir l’alinéa e)], ajouter 10 ml de tampon glycine à
1 mol/l pH 5,5 à l’échantillon et rincer en manipulant l’échantillon de façon à le faire sortir du sac.
Une fois le surnageant éliminé des tubes à centrifuger, ajouter le produit de rinçage de l’échantillon
dans les tubes. Ajouter encore 10 ml de tampon glycine à 1 mol/l pH 5,5 dans le sac, manipuler à
nouveau le produit et l’eau de façon à les faire sortir du sac et ajouter le produit de rinçage dans les
tubes. Centrifuger conformément à l’alinéa e).
e) Centrifuger l’éluat à 2 500g maximum pendant 10 min sans frein.
NOTE 1 Une centrifugation à 2 500g maximum peut produire un culot très compact. Une vitesse moins
élevée de 1 100g maximum pendant 10 min sans frein s’est révélée donner des rendements de récupération
d’oocystes de Cryptosporidium et de kystes de Giardia au moins équivalents.
f) À l’aide d’une pipette et d’une source de vide, prélever le surnageant sans perturber le culot. Si
aucun culot n’est visible, agir avec le plus grand soin pour s’assurer qu’aucun parasite n’est perdu
pendant l’aspiration. Pour cela, laisser un petit volume de liquide au fond du tube.
g) Remettre le culot en suspension dans le liquide résiduel restant au fond de chaque tube et combiner
les culots dans un seul tube à centrifuger.
h) Rincer les tubes à centrifuger coniques de 50 ml vides avec de l’eau distillée stérile et transvaser le
produit de rinçage dans le tube contenant les culots combinés. Répéter cette opération jusqu’à ce
que le volume du culot en suspension dans le tube ne dépasse pas la capacité du tube.
© ISO 2016 – Tous droits réservés 5

---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO 18744:2016(F)

i) Centrifuger l’éluat à 2 500g maximum pendant 10 min sans frein.
NOTE 2 Une centrifugation à 2 500g maximum peut produire un culot très compact. Une vitesse moins
élevée de 1 100g maximum pendant 10 min sans frein s’est révélée donner des rendements de récupération
d’oocystes de Cryptosporidium et de kystes de Giardia au moins équivalents.
j) À l’aide d’une pipette et d’une source de vide, prélever le surnageant sans perturber le culot. Si
aucun culot n’est visible, agir avec le plus grand soin pour s’assurer qu’aucun parasite n’est perdu
pendant l’aspiration. Pour cela, laisser un petit volume de liquide au fond du tube.
k) Estimer le volume du culot final.
l) Remettre le culot en suspension dans 1 ml d’eau et transvaser dans un tube de Leighton. Rincer le
tube à centrifuger avec 2 ml d’eau et transvaser dans le tube de Leighton. Répéter jusqu’à ce que le
tube de Leighton contienne 9 ml d’échantillon.
Si le volume du culot dépasse le volume recommandé par le fabricant du kit d’essai IMS, diviser
l’échantillon en aliquotes ne dépassant pas ce volume. Compléter chaque aliquote à 9 ml avec de
l’eau déionisée.
NOTE 3 À ce stade, le tube de Leighton peut être bouché et placé au réfrigérateur, et le processus
interrompu pendant 24 h.
8.2 Récupération des parasites sur des fruits à baies
a) Placer l’échantillon dans un récipient avec couvercle de 500 ml. Éviter toute manipulation inutile.
Utiliser des pinces au besoin.
Il est recommandé d’ajouter à chaque échantillon une suspension de contrôles internes d’extraction
contenant une quantité définie d’oocystes de Cryptosporidium et/ou de kystes de Giardia
préalablement marqués et dénombrés, conformément aux instructions du fabricant. Il convient de
déposer la suspension sur la surface des baies, après avoir placé l’échantillon dans le récipient de
traitement. Il convient que le marqueur fluorescent présent dans le contrôle interne d’extraction soit
différent de celui utilisé pour détecter les (oo)cystes cibles. Si aucun contrôle interne d’extraction
n’est utilisé, il est recommandé d’employer un contrôle de processus positif (voir en 9.2).
b) Ajouter 200 ml de tampon glycine à 1 mol/l pH 3,5.
c) Agiter doucement l’échantillon pendant 1 min (par exemple en le faisant rouler ou en l’agitant
lentement) pour réduire au maximum le risque d’endommagement de l’échantillon.
d) Transvaser l’éluat dans des tubes à centrifuger coniques. Si l’échantillon a libéré une quantité
excessive de débris, verser l’éluat sur un tamis ou un filtre d’un sac de mélangeur à pales et recueillir
l’éluat dans des tubes à centrifuger coniques en le laissant s’écouler à travers le filtre pendant 5 min.
NOTE 1 L’éluat peut être transvasé dans un flacon à centrifuger à fond conique de 250 ml, si une
centrifugeuse/un rotor approprié(e) est disponible pour l’étape suivante.
e) Rincer le récipient (ainsi que le tamis ou le filtre et le sac de mélangeur à pales s’il est utilisé à
l’alinéa d)) avec 50 ml de tampon glycine à 1 mol/l pH 3,5.
f) Transvaser le produit de rinçage dans les tubes à centrifuger coniques.
g) Centrifuger l’éluat à 2 500g maximum pendant 10 min sans frein.
NOTE 2 Une centrifugation à 2 500g maximum peut produire un culot très compact. Une vitesse moins
élevée de 1 100g maximum pendant 10 min sans frein s’est révélée donner des rendements de récupération
d’oocystes de Cryptosporidium et de kystes de Giardia au moins équivalents.
h) À l’aide d’une pipette et d’une source de vide, prélever soigneusement le surnageant sans perturber
le culot
...

PROJET
NORME ISO/FDIS
FINAL
INTERNATIONALE 18744
ISO/TC 34/SC 9
Microbiologie de la chaîne
Secrétariat: AFNOR
alimentaire — Recherche et
Début de vote:
2015-12-10 dénombrement des Cryptosporidium
et Giardia dans les légumes verts frais
Vote clos le:
2016-02-10
à feuilles et les fruits à baies
Microbiology of the food chain — Detection and enumeration of
Cryptosporidium and Giardia in fresh leafy green vegetables and
berry fruits
LES DESTINATAIRES DU PRÉSENT PROJET SONT
INVITÉS À PRÉSENTER, AVEC LEURS OBSER-
Veuillez consulter les notes administratives en page iii
VATIONS, NOTIFICATION DES DROITS DE PRO-
PRIÉTÉ DONT ILS AURAIENT ÉVENTUELLEMENT
CONNAISSANCE ET À FOURNIR UNE DOCUMEN-
TATION EXPLICATIVE.
OUTRE LE FAIT D’ÊTRE EXAMINÉS POUR
ÉTABLIR S’ILS SONT ACCEPTABLES À DES FINS
INDUSTRIELLES, TECHNOLOGIQUES ET COM-
Numéro de référence
MERCIALES, AINSI QUE DU POINT DE VUE
ISO/FDIS 18744:2015(F)
DES UTILISATEURS, LES PROJETS DE NORMES
INTERNATIONALES DOIVENT PARFOIS ÊTRE
CONSIDÉRÉS DU POINT DE VUE DE LEUR POSSI-
BILITÉ DE DEVENIR DES NORMES POUVANT
SERVIR DE RÉFÉRENCE DANS LA RÉGLEMENTA-
©
TION NATIONALE. ISO 2015

---------------------- Page: 1 ----------------------
ISO/FDIS 18744:2015(F)

TRAITEMENT PARALLÈLE ISO/CEN
Le présent projet final a été élaboré dans le cadre de l’Organisation internationale de normalisation (ISO) et
soumis selon le mode de collaboration sous la direction de l’ISO, tel que défini dans l’Accord de Vienne. Le
projet final a été établi sur la base des observations reçues lors de l’enquête parallèle sur le projet.
Le projet final est par conséquent soumis aux comités membres de l’ISO et aux comités membres du CEN en
parallèle à un vote d’approbation de deux mois au sein de l’ISO et à un vote formel au sein du CEN.
Les votes positifs ne doivent pas être accompagnés d’observations.
Les votes négatifs doivent être accompagnés des arguments techniques pertinents.
DOCUMENT PROTÉGÉ PAR COPYRIGHT
© ISO 2015, Publié en Suisse
Droits de reproduction réservés. Sauf indication contraire, aucune partie de cette publication ne peut être reproduite ni utilisée
sous quelque forme que ce soit et par aucun procédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie, l’affichage sur
l’internet ou sur un Intranet, sans autorisation écrite préalable. Les demandes d’autorisation peuvent être adressées à l’ISO à
l’adresse ci-après ou au comité membre de l’ISO dans le pays du demandeur.
ISO copyright office
Ch. de Blandonnet 8 • CP 401
CH-1214 Vernier, Geneva, Switzerland
Tel. +41 22 749 01 11
Fax +41 22 749 09 47
copyright@iso.org
www.iso.org
ii © ISO 2015 – Tous droits réservés

---------------------- Page: 2 ----------------------
ISO/FDIS 18744:2015(F)

Sommaire Page
Avant-propos .iv
Introduction .v
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Termes et définitions . 1
4 Principe . 2
5 Réactifs . 2
6 Appareillage . 3
7 Échantillonnage et transport . 4
7.1 Échantillonnage . 4
7.2 Transport . 4
7.3 Réception des échantillons . 4
7.4 Conservation . 4
7.5 Préparation de l’échantillon pour essai . 4
8 Mode opératoire. 5
8.1 Récupération des parasites sur des légumes verts à feuilles . 5
8.2 Récupération des parasites sur des fruits à baies . 6
8.3 Séparation immunomagnétique (IMS) . 7
8.4 Coloration de l’échantillon . 7
8.5 Examen au microscope . 8
8.5.1 Commentaires généraux . 8
8.5.2 Examen des préparations d’échantillons au microscope à épifluorescence . 9
8.5.3 Examen des préparations d’échantillons au microscope CID .11
9 Procédures de contrôle qualité .13
9.1 Généralités .13
9.2 Inclusion et interprétation des contrôles .13
9.3 Nettoyage de l’équipement .13
10 Compte-rendu des résultats .13
10.1 Expression des résultats .13
10.2 Rapport d’essai .14
Annexe A (normative) Préparation des réactifs .15
Annexe B (normative) Préparation des suspensions de contrôle de processus positives .17
Annexe C (informative) Pourcentages de rendement obtenus avec les méthodes .19
Bibliographie .21
© ISO 2015 – Tous droits réservés iii

---------------------- Page: 3 ----------------------
ISO/FDIS 18744:2015(F)

Avant-propos
L’ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d’organismes
nationaux de normalisation (comités membres de l’ISO). L’élaboration des Normes internationales est
en général confiée aux comités techniques de l’ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude
a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales,
gouvernementales et non gouvernementales, en liaison avec l’ISO participent également aux travaux.
L’ISO collabore étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (IEC) en ce qui
concerne la normalisation électrotechnique.
Les procédures utilisées pour élaborer le présent document et celles destinées à sa mise à jour sont
décrites dans les Directives ISO/IEC, Partie 1. Il convient, en particulier de prendre note des différents
critères d’approbation requis pour les différents types de documents ISO. Le présent document a été
rédigé conformément aux règles de rédaction données dans les Directives ISO/IEC, Partie 2 (voir www.
iso.org/directives).
L’attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l’objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L’ISO ne saurait être tenue pour responsable
de ne pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence. Les détails concernant
les références aux droits de propriété intellectuelle ou autres droits analogues identifiés lors de
l’élaboration du document sont indiqués dans l’Introduction et/ou dans la liste des déclarations de
brevets reçues par l’ISO (voir www.iso.org/brevets).
Les appellations commerciales éventuellement mentionnées dans le présent document sont données
pour information, par souci de commodité à l’intention des utilisateurs et ne sauraient constituer
un engagement.
Pour une explication de la signification des termes et expressions spécifiques de l’ISO liés à
l’évaluation de la conformité, ou pour toute information au sujet de l’adhésion de l’ISO aux principes
de l’OMC concernant les obstacles techniques au commerce (OTC), voir le lien suivant: Avant-propos —
Informations supplémentaires.
Le comité chargé de l’élaboration du présent document est l’ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-
comité SC 9, Microbiologie.
iv © ISO 2015 – Tous droits réservés

---------------------- Page: 4 ----------------------
ISO/FDIS 18744:2015(F)

Introduction
Cryptosporidium sp. et Giardia duodenalis (syn. G. lamblia, G. intestinalis) sont des parasites protozoaires
pouvant causer des maladies entériques chez l’homme. Ces organismes sont tous les deux caractérisés
par un stade de transmission résistant, l’oocyste de Cryptosporidium et le kyste de Giardia, qui peuvent
survivre dans des environnements humides pendant de longues périodes. Ces stades de transmission
sont ci-après appelés collectivement (oo)cystes. Les oocystes de Cryptosporidium en particulier sont très
résistants au chlore aux concentrations utilisées dans le traitement de l’eau potable, et la désinfection
chimique des légumes verts à feuilles et fruits à baies, lorsqu’elle est effectuée pendant le traitement,
peut également être inefficace. Par conséquent, l’absence de bactéries végétatives sur les produits frais
en tant qu’indicateurs de contamination fécale, n’est pas forcément synonyme d’absence d’(oo)cystes. Il
n’existe aucune méthode de culture de Cryptosporidium spp. et Giardia duodenalis à des fins de détection
et, par conséquent, pour détecter une contamination par ces parasites, il faut isoler directement les
(oo)cystes sur l’échantillon alimentaire puis les observer au microscope. Les méthodes décrites dans la
présente Norme internationale servent à déterminer si des (oo)cystes de Cryptosporidium et/ou Giardia
sont présents à la surface des produits frais et à les dénombrer. La présente Norme internationale
repose sur les méthodes publiées qui ont été soumises à essai lors d’une étude multicentrique
interlaboratoires. D’autres méthodes peuvent être utilisées s’il est démontré qu’elles sont équivalentes
[1]
à la présente Norme internationale, suivant le protocole décrit dans l’ISO 16140.
© ISO 2015 – Tous droits réservés v

---------------------- Page: 5 ----------------------
PROJET FINAL DE NORME INTERNATIONALE ISO/FDIS 18744:2015(F)
Microbiologie de la chaîne alimentaire — Recherche et
dénombrement des Cryptosporidium et Giardia dans les
légumes verts frais à feuilles et les fruits à baies
AVERTISSEMENT — Il convient que l’utilisateur de la présente Norme internationale connaisse
bien les pratiques courantes de laboratoire. La présente Norme internationale n’a pas pour but de
traiter de tous les problèmes de sécurité qui sont, le cas échéant, liés à son utilisation. Il incombe
à l’utilisateur de la présente norme d’établir des pratiques appropriées en matière d’hygiène et
de sécurité et de s’assurer de la conformité à la réglementation nationale en vigueur.
1 Domaine d’application
La présente Norme internationale spécifie une méthode applicable à la détection et au dénombrement
des oocystes de Cryptosporidium et aux kystes de Giardia sur ou dans des produits alimentaires qui
sont décrits ici comme étant des légumes verts frais à feuilles et des fruits à baies. Grâce à des contrôles
appropriés, elle peut être également applicable à l’examen d’autres produits frais.
Les descriptions faites au microscope concernent les oocystes de Cryptosporidium spp. et les kystes de
Giardia duodenalis dont la taille inclut les espèces (Cryptosporidium) ou assemblages (Giardia) connus
pour être pathogènes pour l’homme.
Cette méthode n’inclut pas l’analyse moléculaire et n’est donc pas applicable à la détermination des
espèces ou des génotypes/assemblages d’oocystes de Cryptosporidium et de kystes de Giardia. La
méthode permettra de détecter toutes les espèces et tous les génotypes/assemblages connus pour être
pathogènes pour l’homme ainsi que d’autres qui ne le sont pas. Pour mieux les identifier, des essais de
typage moléculaire sont requis. Toutefois, ceux-ci ne peuvent pas être effectués de manière fiable si
des contrôles de processus positifs ont été ajoutés aux échantillons, car le résultat des essais de typage
moléculaire sera erroné.
Cette méthode ne permet pas de déterminer la viabilité ou l’infectivité des oocystes de Cryptosporidium
et des kystes de Giardia qui peuvent être présents.
2 Références normatives
Les documents ci-après, dans leur intégralité ou non, sont des références normatives indispensables à
l’application du présent document. Pour les références datées, seule l’édition citée s’applique. Pour les
références non datées, la dernière édition du document de référence s’applique (y compris les éventuels
amendements).
ISO 7218:2007, Microbiologie des aliments — Exigences générales et recommandations
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et les définitions suivants s’appliquent.
3.1
oocyste de Cryptosporidium
stade de transmission de Cryptosporidium sp.
Note 1 à l’article: Sa détection est basée sur la réaction avec des anticorps anti-Cryptosporidium spécifiques et les
caractéristiques morphologiques décrites dans l’Article 8.
© ISO 2015 – Tous droits réservés 1

---------------------- Page: 6 ----------------------
ISO/FDIS 18744:2015(F)

3.2
kyste de Giardia
stade de transmission de Giardia sp.
Note 1 à l’article: Sa détection est basée sur la réaction avec des anticorps anti-Giardia spécifiques et les
caractéristiques morphologiques typiques décrites dans l’Article 8.
3.3
légume vert frais à feuilles
feuille de plantes consommée comme un légume, qui n’a été soumise à aucun processus, excepté peut-
être le découpage et le lavage
3.4
fruit frais à baies
petit fruit rond ou oblong, charnu et juteux, qui n’a été soumis à aucun processus excepté peut-être le
découpage et le lavage
3.5
contrôle interne d’extraction
(oo)cystes marqués à l’aide de marqueurs fluorescents spécifiques qui peuvent être ajoutés dans des
quantités définies à l’échantillon avant le traitement pour vérifier que la méthode consécutive à l’étape
d’élution est efficace
3.6
contrôle positif
échantillon dans lequel des (oo)cystes ont été ajoutés dans des quantités définies avant l’extraction
pour vérifier que la méthode consécutive à l’étape d’élution est efficace
3.7
contrôle négatif
échantillon ayant une quantité de matière équivalente à celle de l’échantillon soumis à essai, qui est
considéré comme étant exempt d’(oo)cystes et traité comme l’échantillon soumis à essai
4 Principe
Le principe de la méthode repose sur la récupération des (oo)cystes de l’échantillon par un mode
opératoire d’élution, suivie d’une concentration dans l’éluat par centrifugation et isolement par
séparation immunomagnétique (IMS). La détection des (oo)cystes est effectuée au microscope après
marquage avec des anticorps monoclonaux (mAb) spécifiques conjugués à un fluorochrome.
5 Réactifs
5.1 Réactifs requis pour éluer les (oo)cystes des légumes verts à feuilles et des fruits à baies
5.1.1 Tampon glycine, pH 5,5 pour les légumes verts à feuilles (A.2.1).
5.1.2 Tampon glycine, pH 3,5 pour les fruits à baies (A.2.2).
5.2 Réactifs requis pour la concentration, la fixation, la coloration, la détection et le contrôle
qualité
5.2.1 Méthanol, de qualité analytique.
5.2.2 Billes paramagnétiques, couplées à des anticorps spécifiques des parois des oocystes de
Cryptosporidium et des kystes de Giardia.
2 © ISO 2015 – Tous droits réservés

---------------------- Page: 7 ----------------------
ISO/FDIS 18744:2015(F)

5.2.3 Acide chlorhydrique, 0,1 mol/l (A.3.1).
5.2.4 Hydroxyde de sodium, 1 mol/l (A.3.2).
5.2.5 Anticorps monoclonaux (mAb) fluorescents dirigés contre les oocystes de Cryptosporidium et
les kystes de Giardia.
5.2.6 Milieu de montage pour immunofluorescence (A.3.3).
5.2.7 Dichlorhydrate de 4’,6’-diamidino-2-phénylindole dihydraté (DAPI), réactif lyophilisé.
5.2.8 Solution mère de DAPI (A.3.4).
5.2.9 Solution de travail de DAPI (A.3.5).
5.2.10 Tampon phosphate salin (PBS), pH 7,3 (A.1.1).
5.2.11 Huile à immersion non fluorescente.
5.2.12 Suspensions mères d’oocystes de Cryptosporidium et de kystes de Giardia (Annexe B).
5.2.13 Suspensions d’oocystes de Cryptosporidium et de kystes de Giardia non viables
préalablement marqués et dénombrés.
Le marqueur fluorochrome doit être différent de celui utilisé pour détecter l’organisme cible.
5.2.14 Milieu de conservation des parasites (A.3.6 et A.3.7).
5.2.15 Eau déminéralisée et filtrée (eau ultra-pure de type 1).
5.2.16 Vernis à ongles (pour sceller les lamelles couvre-objet sur les lames, si nécessaire).
6 Appareillage
Cette méthode requiert l’utilisation d’un matériel courant de laboratoire de microbiologie (se référer à
l’ISO 7218), et en particulier, ce qui suit.
6.1 Pinces, pour manipuler les produits frais si nécessaire.
6.2 Mélangeur à pales (péristaltique) et sacs à filtre compatibles.
6.3 Centrifugeuse swing-out (pour recevoir au moins 4 tubes à centrifuger coniques de 50 ml par
cycle).
6.4 Tubes de Leighton en verre.
6.5 Mélangeur rotatif compatible avec les tubes de Leighton.
6.6 Porte-pinces magnétique compatible avec les tubes de Leighton.
6.7 Porte-pinces magnétique pour tubes de microcentrifugeuse.
© ISO 2015 – Tous droits réservés 3

---------------------- Page: 8 ----------------------
ISO/FDIS 18744:2015(F)

6.8 Lames à puits, recouvertes d’un revêtement hydrophobe, puits d’une capacité volumique de 50 µl
d’échantillon traité après IMS, et lamelles couvre-objet de taille appropriée.
6.9 Chauffe-lames, incubateur réglé entre 37 °C et 42 °C, ou appareil de séchage des lames.
6.10 Chambre humide, boîte avec couvercle contenant un matériau absorbant l’humidité, par exemple
une serviette en papier, qui peut être maintenue à la température et à l’humidité appropriées au réactif
immunofluorescent.
6.11 Dispositif d’aspiration, source de vide équipée d’un piège à liquide et d’une pipette, ou équivalent.
6.12 Microscope à épifluorescence équipé d’objectifs 20x et 40x ainsi que d’une lentille à
immersion d’objectif 100x et d’un oculaire (réticule) étalonné. Doit comprendre un ensemble de
filtres adaptés à l’isothyocyanate de fluorescéine (FITC) (excitation de 480 nm, émission de 520 nm) et
un ensemble de filtres DAPI (excitation de 375 nm, émission > 420 nm). En cas d’utilisation de contrôles
internes d’extraction, un autre ensemble de filtres adapté au fluorochrome sera nécessaire. Un système
optique à contraste interférentiel différentiel (CID) est utile. Un système d’enregistrement photographique
fixé au microscope peut être utile pour enregistrer les événements positifs ou présomptifs.
6.13 Lame de contrôle FITC servant à évaluer l’intensité de fluorescence et à vérifier le bon
fonctionnement du système optique du microscope à fluorescence.
7 Échantillonnage et transport
7.1 Échantillonnage
La présente Norme internationale ne spécifie aucun mode opératoire d’échantillonnage. Voir la Norme
internationale spécifique relative au produit concerné. En l’absence de Norme internationale spécifique,
il est recommandé aux parties prenantes concernées (par exemple, autorités compétentes, organismes
de réglementation, clients) de trouver un accord à ce sujet.
7.2 Transport
Les échantillons de fruits mous et autres échantillons délicats doivent être manipulés avec soin pendant
le transport pour préserver leur intégrité physique (se référer à l’ISO 7218:2007, 8.2).
7.3 Réception des échantillons
Il convient d’évaluer les échantillons en fonction de critères d’acceptation basés sur des lignes directrices
appropriées dans le cadre de l’essai (se référer à l’ISO 7218:2007, 8.3). Les légumes verts frais à feuilles
et les fruits à baies doivent être considérés comme étant périssables et être analysés dès que possible
après leur réception. Les critères de rejet peuvent inclure la présence de moisissure, la décomposition
de l’échantillon ou la perte d’intégrité de l’échantillon en cas de fruit à baies.
7.4 Conservation
Les légumes verts frais à feuilles et les fruits à baies peuvent être conservés au réfrigérateur (entre 4 °C
et 8 °C), pour réduire le risque de détérioration des échantillons (se référer à l’ISO 7218:2007, 8.4).
7.5 Préparation de l’échantillon pour essai
L’état des produits frais doit être consigné avant de commencer l’analyse.
Les échantillons pour essai doivent peser au moins 25 g.
4 © ISO 2015 – Tous droits réservés

---------------------- Page: 9 ----------------------
ISO/FDIS 18744:2015(F)

Il est recommandé de ne pas analyser plus de 100 g d’échantillon individuel par analyse.
Lors de l’analyse de légumes verts à feuilles entières, par exemple la laitue pommée, il est recommandé
de choisir au hasard des feuilles propres intactes (sans les tiges) provenant de différentes parties de la
plante et de les examiner.
Pour les échantillons sous forme de petites unités, par exemple les framboises, l’échantillon doit être un
échantillon aléatoire de ces unités.
8 Mode opératoire
8.1 Récupération des parasites sur des légumes verts à feuilles
a) Placer l’échantillon dans un sac à filtre. Éviter toute manipulation inutile. Utiliser des pinces au besoin.
Il est recommandé d’ajouter à chaque échantillon une suspension de contrôles internes d’extraction
contenant une quantité définie d’oocystes de Cryptosporidium et/ou de kystes de Giardia
préalablement marqués et dénombrés, conformément aux instructions du fabricant. Il convient de
déposer la suspension de contrôles sur la surface des feuilles, après avoir placé l’échantillon dans
le récipient de traitement. Il convient que le marqueur fluorescent présent dans le contrôle interne
d’extraction soit différent de celui utilisé pour détecter les (oo)cystes cibles dans les échantillons
pour essai. Si aucun contrôle interne d’extraction n’est utilisé, il est recommandé d’employer un
contrôle de processus positif (voir en 9.2).
b) Ajouter 200 ml de tampon glycine pH 5,5.
c) Placer pendant 30 s l’échantillon dans un mélangeur à pales tournant entre 200 tr/min et 300 tr/min.
d) Recueillir l’éluat dans des tubes à centrifuger à fond conique de 50 ml, en y répartissant l’éluat en
quantités égales et en s’assurant que toute la matière végétale est retenue dans le filtre. Appuyer
fermement sur le sac et sur le filtre pour s’assurer que tout l’éluat est extrait de l’échantillon. L’éluat
peut être recueilli dans un récipient avant de le transvaser dans des tubes à centrifuger.
L’éluat peut aussi être transvasé dans un flacon à centrifuger à fond conique de 250 ml, si une
centrifugeuse/un rotor approprié(e) est disponible pour l’étape suivante.
Rincer l’échantillon après lavage peut accroître le rendement. Après avoir transvasé l’éluat depuis
le sac à filtre, tout en centrifugeant les tubes [voir l’alinéa e)], ajouter 10 ml de tampon glycine à
1 mol/l pH 5,5 à l’échantillon et rincer en manipulant l’échantillon de façon à le faire sortir du sac.
Une fois le surnageant éliminé des tubes à centrifuger, ajouter le produit de rinçage de l’échantillon
dans les tubes. Ajouter encore 10 ml de tampon glycine à 1 mol/l pH 5,5 dans le sac, manipuler à
nouveau le produit et l’eau de façon à les faire sortir du sac et ajouter le produit de rinçage dans les
tubes. Centrifuger conformément à l’alinéa e).
e) Centrifuger l’éluat à 2 500 g maximum pendant 10 min sans frein.
NOTE 1 Une centrifugation à 2 500 g maximum peut produire un culot très compact. Une vitesse moins
élevée de 1 100 g maximum pendant 10 min sans frein s’est révélée donner des rendements de récupération
d’oocystes de Cryptosporidium et de kystes de Giardia au moins équivalents.
f) À l’aide d’une pipette et d’une source de vide, prélever le surnageant sans perturber le culot. Si
aucun culot n’est visible, agir avec le plus grand soin pour s’assurer qu’aucun parasite n’est perdu
pendant l’aspiration. Pour cela, laisser un petit volume de liquide au fond du tube.
g) Remettre le culot en suspension dans le liquide résiduel restant au fond de chaque tube et combiner
les culots dans un seul tube à centrifuger.
h) Rincer les tubes à centrifuger coniques de 50 ml vides avec de l’eau distillée stérile et transvaser le
produit de rinçage dans le tube contenant les culots combinés. Répéter cette opération jusqu’à ce
que le volume du culot en suspension dans le tube ne dépasse pas la capacité du tube.
© ISO 2015 – Tous droits réservés 5

---------------------- Page: 10 ----------------------
ISO/FDIS 18744:2015(F)

i) Centrifuger l’éluat à 2 500 g maximum pendant 10 min sans frein.
NOTE 2 Une centrifugation à 2 500 g maximum peut produire un culot très compact. Une vitesse moins
élevée de 1 100 g maximum pendant 10 min sans frein s’est révélée donner des rendements de récupération
d’oocystes de Cryptosporidium et de kystes de Giardia au moins équivalents.
j) À l’aide d’une pipette et d’une source de vide, prélever le surnageant sans perturber le culot. Si
aucun culot n’est visible, agir avec le plus grand soin pour s’assurer qu’aucun parasite n’est perdu
pendant l’aspiration. Pour cela, laisser un petit volume de liquide au fond du tube.
k) Estimer le volume du culot final.
l) Remettre le culot en suspension dans 1 ml d’eau et transvaser dans un tube de Leighton. Rincer le
tube à centrifuger avec 2 ml d’eau et transvaser dans le tube de Leighton. Répéter jusqu’à ce que le
tube de Leighton contienne 9 ml d’échantillon.
Si le volume du culot dépasse le volume recommandé par le fabricant du kit d’essai IMS, diviser
l’échantillon en aliquotes ne dépassant pas ce volume. Compléter chaque aliquote à 9 ml avec de
l’eau déionisée.
NOTE 3 À ce stade, le tube de Leighton peut être bouché et placé au réfrigérateur, et le processus
interrompu pendant 24 h.
8.2 Récupération des parasites sur des fruits à baies
a) Placer l’échantillon dans un récipient avec couvercle de 500 ml. Éviter toute manipulation inutile.
Utiliser des pinces au besoin.
Il est recommandé d’ajouter à chaque échantillon une suspension de contrôles internes d’extraction
contenant une quantité définie d’oocystes de Cryptosporidium et/ou de kystes de Giardia
préalablement marqués et dénombrés, conformément aux instructions du fabricant. Il convient de
déposer la suspension sur la surface des baies, après avoir placé l’échantillon dans le récipient de
traitement. Il convient que le marqueur fluorescent présent dans le contrôle interne d’extraction soit
différent de celui utilisé pour détecter les (oo)cystes cibles. Si aucun contrôle interne d’extraction
n’est utilisé, il est recommandé
...