ISO 11290-2:1998
(Main)Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes — Part 2: Enumeration method
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the detection and enumeration of Listeria monocytogenes — Part 2: Enumeration method
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche et le dénombrement de Listeria monocytogenes — Partie 2: Méthode de dénombrement
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 11290-2
First edition
1998-07-01
Microbiology of food and animal feeding
stuffs — Horizontal method for the
detection and enumeration of Listeria
monocytogenes —
Part 2:
Enumeration method
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche et le
dénombrement de Listeria monocytogenes —
Partie 2: Méthode de dénombrement
A
Reference number
ISO 11290-2:1998(E)
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ISO 11290-2:1998(E)
Contents Page
1 Scope . 1
2 Normatives references . 1
3 Definitions . 2
4 Principle . 2
Culture media and reagents .
5 2
6 Apparatus and glassware . 2
7 Sampling . 3
8 Preparation of test sample . 4
9 Procedure . 4
Expression of results (see ISO 7218) .
10 8
11 Precision . 9
12 Quality control of culture media . 10
13 Test report . 10
(normative) .
Annex A Diagram of procedure 11
Annex B (normative) Composition and preparation of media and
reagents . 12
Annex C (informative) Henry illumination test . 20
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All rights reserved. Unless otherwise specified, no part of this publication may be reproduced
or utilized in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying and
microfilm, without permission in writing from the publisher.
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Printed in Switzerland
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ISO ISO 11290-2:1998(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide
federation of national standards bodies (ISO member bodies). The work of
preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which
a technical committee has been established has the right to be represented
on that committee. International organizations, governmental and non-
governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO
collaborates closely with the International Electrotechnical Commission
(IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
Draft International Standards adopted by the technical committees are
circulated to the member bodies for voting. Publication as an International
Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting
a vote.
International Standard ISO 11290-2 was prepared by Technical Committee
ISO/TC 34, Agricultural food products, Subcommittee SC 9, Microbiology.
ISO 11290 consists of the following parts, under the general title
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the
detection and enumeration of Listeria monocytogenes:
— Part 1: Detection method
— Part 2: Enumeration method
Annexes A and B form an integral part of this part of ISO 11290. Annex C
is for information only.
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Introduction
Because of the large variety of food and feed products, this horizontal
method may not be appropriate in every detail for certain products. In this
case, different methods, which are specific to these products may be used
if absolutely necessary for justified technical reasons. Nevertheless, every
attempt should be made to apply this horizontal method as far as possible.
When this part of ISO 11290 is next reviewed, account will be taken of all
information then available regarding the extent to which this horizontal
method has been followed and the reasons for deviations from this method
in the case of particular products.
The harmonization of test methods cannot be immediate, and for certain
groups of products International Standards and/or national standards may
already exist that do not comply with this horizontal method. It is hoped that
when such standards are reviewed they will be changed to comply with this
part of ISO 11290 so that eventually the only remaining departures from
this horizontal method will be those necessary for well-established
technical reasons.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO ISO 11290-2:1998(E)
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal
method for the detection and enumeration of Listeria
monocytogenes —
Part 2:
Enumeration method
WARNING — In order to safeguard the health of laboratory personnel, it is strongly recommended that
tests for detecting Listeria monocytogenes are undertaken in properly equipped laboratories, under the
control of a skilled microbiologist, and that great care is taken in the disposal of all contaminated materials.
In particular, it is strongly recommended that female laboratory staff are made aware of the particular risk
to the developing foetus presented by infection of the mother through exposure to Listeria mono-
cytogenes. National legislation may involve more specific demands.
1 Scope
This part of ISO 11290 specifies a horizontal method for the enumeration of Listeria monocytogenes.
NOTE — The method also allows enumeration of other Listeria species which may be used as indicators of the hygienic
quality of food or feed products.
Subject to the limitations discussed in the introduction, this part of ISO 11290 is applicable to products intended for
human consumption or animal foodstuffs.
In general (see note in 9.2.1), the lower limit of enumeration of this method is 10 L. monocytogenes per millilitre of
sample for liquid products, or 100 L. monocytogenes per gram of sample for other products.
2 Normative references
The following standards contain provisions which, through reference to the text, constitute provisions of this
International Standard. At the time of publication, the editions indicated were valid. All Standards are subject to
revision, and parties to agreements based on this International Standard are encouraged to investigate the
possibility of applying the most recent editions of standards indicated below. Members of IEC and ISO maintain
registers of currently valid International Standards.
1)
ISO 6887-1:— , Microbiology of food and animal feeding stuffs — Preparation of test samples, initial suspension
and decimal dilutions for microbiological examination — Part 1: General rules for the preparation of the initial
suspension and of decimal dilutions.
ISO 7218:1996, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General rules for microbiological examination.
ISO 11290-1:1996, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the detection and
enumeration of Listeria monocytogenes — Part 1: Detection method.
1) To be published. (Revision of ISO 6887:1993)
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3 Definitions
For the purposes of this part of ISO 11290, the following definitions apply.
3.1
Listeria monocytogenes
microorganisms which form typical colonies on the solid selective medium described and which display the
morphological, physiological and biochemical characteristics described when the analysis is carried out in
accordance with this part of ISO 11290
3.2
enumeration of Listeria monocytogenes
determination of the number of colony-forming units (CFU) of Listeria monocytogenes (see 3.1), in a given quantity
of product, when the analysis is carried out in accordance with this part of ISO 11290
4 Principle
Within the limits of this part of ISO 11290, the enumeration of Listeria monocytogenes requires six successive steps
(see annex A for a flowchart).
4.1 Preparation of the initial suspension in one of the two diluents described, as necessary.
4.2 Resuscitation for 1 h at 20 °C.
4.3 Surface plating, on the solid selective culture medium contained in two Petri dishes, of a specified quantity of
the test sample for liquid products or the initial suspension for other products.
Preparation of other dishes, under the same conditions, using decimal dilutions of the test sample or initial
suspension.
4.4 Incubation of the dishes at 35 °C or 37 °C and examination after 24 h and 48 h.
4.5 Confirmation of presumptive colonies of Listeria monocytogenes with the tests described.
4.6 From the number of confirmed colonies, calculation of the number of Listeria monocytogenes per gram or per
millilitre of the test sample.
5 Culture media and reagents
For current laboratory practice, see ISO 7218.
NOTE — Because of the large number of culture media and reagents, it has been considered preferable, for clarity of the text,
to describe them in annex B.
6 Apparatus and glassware
Usual microbiological equipment (see ISO 7218) and, in particular, the following.
6.1 Apparatus for dry sterilization (oven) or wet sterilization (autoclave)
See ISO 7218.
2
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ISO 11290-2:1998(E)
6.2 Drying cabinet or incubator, capable of being maintained between 25 °C – 1 °C and 50 °C – 1 °C.
6.3 Incubators, for maintaining the inoculated media, plates and tubes within the following temperature ranges:
a) 20 °C – 1 °C (optional);
b) 25 °C – 1 °C (optional);
c) 35 °C – 1 °C or 37 °C – 1 °C.
6.4 Water bath, capable of being maintained at 47 °C – 2 °C.
6.5 Loops and wires of platinum/iridium or nickel/chromium, or Pasteur pipettes or single-use loops.
6.6 Glass or plastic spreaders, sterile.
6.7 pH-meter, capable of being read to the nearest 0,01 pH unit at 25 °C, enabling measurements to be made
which are accurate to – 0,1 pH unit.
6.8 Test tubes or flasks, of appropriate capacity, for sterilization and storage of culture media and incubation of
liquid media.
6.9 Total-delivery graduated pipettes, of nominal capacities 1 ml and 10 ml, graduated respectively in 0,1 ml
and 0,5 ml divisions.
6.10 Petri dishes, of diameter 90 mm and 140 mm.
6.11 Jars, suitable for microaerobic incubation (optional).
6.12 Gas mixture (optional), of specified composition for microaerobic incubation:
5 % to 12 % CO , 5 % to 15 % O , and N up to 100 %.
2 2 2
6.13 Equipment for the Henry illumination test (optional)
See annex B.
6.14 , preferably with phase-contrast.
Microscope
7 Sampling
Sampling is not part of the method specified in this part of ISO 11290. If there is no specific International Standard
dealing with sampling of the product concerned, it is recommended that the parties concerned come to an
agreement on this subject.
It is important that the laboratory receive a sample which is truly representative and has not been damaged or
changed during transport or storage (see ISO 7218).
3
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8 Preparation of test sample
Prepare the test sample in accordance with the specific International Standard appropriate to the product
concerned. If there is no specific International Standard, it is recommended that the parties concerned come to an
agreement on this subject.
9 Procedure
WARNING — Whenever a choice is given between 35 °C or 37 °C for the incubation temperature, this
temperature shall be agreed between the parties concerned and recorded in the test report.
9.1 Test portion, initial suspension and dilutions
See ISO 6887-1 and any specific International Standard appropriate to the product concerned.
Use as diluent for preparing the initial suspension either buffered peptone water (B.1), or half-Fraser broth base
medium (B.2).
Half-Fraser broth base without the addition of selective agents may be used as a diluent for the food or feed
sample when both the detection method (see ISO 11290-1) and this enumeration method are carried out on the
same test sample. This procedure is to avoid the need to prepare two initial suspensions; the selective agents are
added to the suspension once the test portion for enumeration has been used. Use of this procedure should be
noted in the test report.
Let the initial suspension stand for 1 h – 5 min at 20 °C – 2 °C [by using, if necessary, the incubator 6.3 a)], in order
to resuscitate the stressed microorganisms.
If a dilution range is used, prepare it after resuscitation.
9.2 Inoculation and incubation
9.2.1 Transfer, by means of a sterile pipette (6.9), 0,1 ml of the initial suspension (9.1) to each of two dishes of
PALCAM agar (B.3), dried beforehand if necessary in the incubator (6.2).
Repeat the procedure using further decimal dilutions if necessary.
NOTE — When, for certain products, it is necessary to estimate low numbers of Listeria monocytogenes, the limit of
enumeration can be lowered by a factor of 10 by examining 1,0 ml of the initial suspension. Distribute the 1 ml of inoculum
either on the surface of the agar medium in a large Petri dish (140 mm) or over the surface of the agar medium in three small
dishes (90 mm) using a sterile spreader (6.6). In both cases, prepare duplicates by using two large dishes or six small dishes.
9.2.2 Carefully spread the inoculum as quickly as possible over the surface of the agar plate without touching the
2)
sides of the dish with the spreader. Use a fresh sterile spreader for each plate. Leave the plates closed for about
15 min at ambient temperature for the inoculum to be absorbed into the agar.
9.2.3 Invert the dishes prepared in 9.2.2 and place them in an incubator [6.3 c)] set at 35 °C or 37 °C. Incubate
PALCAM agar dishes either microaerobically in a jar (6.11) containing the gas mixture (6.12) or aerobically.
9.3 Enumeration of characteristic colonies
9.3.1 After incubation for 24 h, and for an additional 18 h to 24 h if growth is slight or if no colonies are observed
after 24 h of incubation, examine the dishes (9.2.3) for the presence of colonies presumed to be Listeria spp.
(see 9.3.3)
.
2) It is possible to use the same spreader for a given sample, by beginning with the higher dilution.
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9.3.2 For dishes incubated microaerobically, after incubation leave the PALCAM agar dishes (9.3.1) to air for 1 h to
allow the agar to regain its pink to purple colour.
9.3.3 After 24 h the characteristic colonies of Listeria spp. grow as small or very small greyish green or olive green
colonies, sometimes with black centres, but always with black halos. After 48 h Listeria spp. appear in the form of
green colonies, about 1,5 mm to 2 mm in diameter, with a central depression and surrounded by a black halo.
9.3.4 Count all the colonies presumed to be Listeria spp. (9.3.3) on each dish containing less than 150
characteristic or non-characteristic colonies.
9.4 Confirmation of Listeria spp.
9.4.1 Selection of colonies for confirmation
9.4.1.1 After the period of incubation (9.3.1), keep the dishes containing less than 150 presumptive Listeria spp.
colonies, at all dilutions and, if possible, at two successive dilutions.
Select five of the presumptive colonies on each plate retained. If there are fewer than five presumptive colonies on a
dish, select for confirmation all presumptive colonies.
9.4.1.2 Streak the selected colonies onto the surface of predried plates of tryptone soya yeast extract agar
(TSYEA) (B.4) in a manner which will allow well-separated colonies to develop.
Place the plates in the incubator [6.3 c)] set at 35 °C or 37 °C for 18 h to 24 h or until growth is satisfactory.
Typical colonies are 1 mm to 2 mm in diameter, convex, colourless and opaque with an entire edge. If the colonies
are not well separated, pick a typical Listeria spp. colony onto another TSYEA plate. Carry out the following tests
from colonies of a pure culture on the TSYEA.
NOTE — The Henry illumination test may be conducted if necessary (see annex C and note in B.4.2). The colonies then
appear bluish with a granular surface.
9.4.2 Catalase reaction
Take a colony separated in 9.4.1.2 and suspend it in a drop of hydrogen peroxide solution (B.10) on a slide. The
immediate formation of gas bubbles indicates a positive reaction (see ISO 7218).
9.4.3 Gram staining
Perform the Gram stain on a colony separated in 9.4.1.2 (see ISO 7218). Listeria spp. are revealed as
Gram-positive slim, short rods (of approximately 0,4 μm to 0,5 μm diameter, and 1 μm to 2 μm length).
3)
9.4.4 Motility test (if necessary)
Take a colony separated in 9.4.1.2 and suspend it in a tube containing TSYEB (B.5).
Incubate in the incubator [6.3 b)] set at 25 °C for 8 h to 24 h until a cloudy medium is observed.
Deposit a drop of the above culture using a loop (6.5) onto a clean glass microscope slide. Place a coverslip on top
and examine it with the microscope (6.14). Listeria spp. appear as slim, short rods with tumbling motility.
Cultures grown above 25 °C may fail to exhibit this motion. Always compare them to a known culture. Cocci, large
rods, or rods with rapid swimming motility are not Listeria spp.
3) This examination is not necessary in all cases if the analysis is carried out by a microbiologist who regularly works on the
detection of L. monocytogenes.
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As an alternative test for motility, using an inoculating needle (6.5), stab the motility agar (B.8) with a typical colony
on TSYEA (9.4.1.2). Incubate it for 48 h in the incubator [6.3 b)] set at 25 °C.
Examine for growth around the stab. Listeria spp. are motile, giving a typical umbrella-like growth pattern
immediately below the surface of the agar. If growth is not sufficient, incubate for up to an additional 5 days and
examine the culture during this time.
9.5 Confirmation of L. monocytogenes
9.5.1 Haemolysis test
9.5.1.1 If the morphological and physiological characteristics and catalase reaction are indicative of Listeria spp.,
determine the haemolytic reaction on sheep blood agar dishes (B.6).
Before use, thoroughly dry the blood agar surface, then mark the agar into squares. For each culture, take a colony
separated in 9.4.1.2 and stab one labelled square using a wire (6.5). Also stab positive (L. monocytogenes) and
negative (L. innocua) control cultures.
After incubation at 35 °C or 37 °C for 24 h – 2 h, examine the test strains and controls. L. monocytogenes show
4)
narrow, clear, light zones of ß-haemolysis ; L. innocua show no clear zone around the stab. L. seeligeri show a
weak zone of ß-haemolysis. L. ivanovii usually show wide, clearly delineated zones of ß-haemolysis. Examine the
plates by transparency to compare test cultures with controls.
9.5.1.2 The haemolytic reaction may also be carried out by using the CAMP test (9.5.3), or by using red cells in
suspension as follows. Disperse the colony in 150 μl of TSYEB (B.5); incubate at 35 °C or 37 °C for 2 h. Add 150 μl
of sheep blood red cell suspension (B.12). Incubate at 35 °C or 37 °C for between 15 min and 60 min, then
refrigerate at +3 °C – 2 °C for about 2 h. Examine for the presence or absence of ß-haemolysis. If the reaction is not
definite, leave the culture at +3 °C – 2 °C for up
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 11290-2
Première édition
1998-07-01
Microbiologie des aliments — Méthode
horizontale pour la recherche et le
dénombrement de Listeria
monocytogenes —
Partie 2:
Méthode de dénombrement
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the
detection and enumeration of Listeria monocytogenes —
Part 2: Enumeration method
A
Numéro de référence
ISO 11290-2:1998(F)
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Sommaire
1 Domaine d’application . 1
2 Références normatives . 1
3 Définitions . 2
4 Principe. 2
5 Milieux de culture et réactifs. 2
6 Appareillage et verrerie. 2
7 Échantillonnage . 3
8 Préparation de l'échantillon pour essai. 3
9 Mode opératoire. 4
10 Expression des résultats (voir l'ISO 7218) . 8
11 Fidélité . 9
12 Contrôle de la qualité des milieux de culture . 10
13 Rapport d'essai . 10
Annexe A (normative) Représentation schématique
du mode opératoire . 11
Annexe B (normative) Composition et préparation des milieux
de culture et des réactifs. 12
Annexe C (informative) Test d'illumination de Henry . 21
© ISO 1998
Droits de reproduction réservés. Sauf prescription différente, aucune partie de cette publi-
cation ne peut être reproduite ni utilisée sous quelque forme que ce soit et par aucun pro-
cédé, électronique ou mécanique, y compris la photocopie et les microfilms, sans l'accord
écrit de l'éditeur.
Organisation internationale de normalisation
Case postale 56 • CH-1211 Genève 20 • Suisse
Internet iso@iso.ch
Imprimé en Suisse
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ISO 11290-2:1998(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération
mondiale d'organismes nationaux de normalisation (comités membres de
l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée aux
comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une
étude a le droit de faire partie du comité technique créé à cet effet. Les
organisations internationales, gouvernementales et non gouvernementales,
en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore
étroitement avec la Commission électrotechnique internationale (CEI) en
ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les projets de Normes internationales adoptés par les comités techniques
sont soumis aux comités membres pour vote. Leur publication comme
Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des
comités membres votants.
La Norme internationale ISO 11290-2 a été élaborée par le comité
technique ISO/TC 34, Produits agricoles alimentaires, sous-comité SC 9,
Microbiologie.
L’ISO 11290 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre
général Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la
recherche et le dénombrement de Listeria monocytogenes:
Partie 1: Méthode de recherche
Partie 2: Méthode de dénombrement
Les annexes A et B font partie intégrante de la présente partie de
l’ISO 11290. L’annexe C est donnée uniquement à titre d’information.
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ISO 11290-2:1998(F)
Introduction
En raison de la grande diversité des produits alimentaires, il est possible
que cette méthode horizontale ne soit pas applicable dans tous ses détails
à certains d'entre eux. Dans ce cas, des méthodes différentes, spécifiques
à ces produits, pourront être utilisées si cela s'avère absolument
nécessaire pour des raisons techniques justifiées. Néanmoins, il convient
que tous les efforts soient faits pour appliquer cette méthode horizontale
chaque fois que possible.
Lorsque la présente partie de l'ISO 11290 sera réexaminée, il sera tenu
compte de toutes les évolutions intervenues depuis sa publication et,
notamment, dans quelle mesure cette méthode horizontale aura été suivie
ainsi que les raisons des dérogations dans le cas de produits particuliers.
L'harmonisation de toutes les méthodes d'essai ne peut être réalisée de
façon immédiate; de ce fait, il peut déjà exister des Normes internationales
et/ou nationales pour certains groupes de produits, qui ne concordent pas
avec cette méthode horizontale. Lorsque de telles normes viendront en
révision, il serait souhaitable de les aligner avec les prescriptions de la
présente partie de l'ISO 11290 et de ne conserver que les seules
divergences justifiées indispensables pour des raisons techniques.
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NORME INTERNATIONALE © ISO ISO 11290-2:1998(F)
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la
recherche et le dénombrement de Listeria monocytogenes —
Partie 2:
Méthode de dénombrement
AVERTISSEMENT — Afin de sauvegarder la santé du personnel de laboratoire, il est fortement
recommandé que les essais de dénombrement des Listeria monocytogenes soient réalisés dans les
laboratoires équipés à cet effet et sous la surveillance d'un microbiologiste expérimenté, et qu'un grand
soin soit pris pour se débarrasser des éléments contaminés. Il est en particulier fortement recommandé
que le personnel féminin du laboratoire soit informé du risque particulier pour le fœtus en développement,
d'infection de la mère par exposition aux Listeria monocytogenes. Des législations nationales peuvent
prévoir des dispositions plus spécifiques.
1 Domaine d’application
La présente partie de l'ISO 11290 spécifie une méthode horizontale pour le dénombrement des Listeria
monocytogenes.
NOTE La méthode permet également le dénombrement d'autres espèces de Listeria qui peuvent être utilisées comme
indicateurs de la qualité hygiénique de l'aliment.
La présente partie de l'ISO 11290 est applicable aux produits destinés à la consommation humaine ou à
l'alimentation animale, avec les quelques restrictions signalées dans l'introduction.
D'une façon générale (voir la note en 9.2.1), la limite inférieure de dénombrement de cette méthode est de 10
L. monocytogenes par millilitre d'échantillon pour les produits liquides, et de 100 L. monocytogenes par gramme
d'échantillon pour les autres produits.
2 Références normatives
Les normes suivantes contiennent des dispositions qui, par suite de la référence qui en est faite, constituent des
dispositions valables pour la présente partie de l’ISO 11290. Au moment de la publication, les éditions indiquées
étaient en vigueur. Toute norme est sujette à révision et les parties prenantes des accords fondés sur la présente
partie de l’ISO 11290 sont invitées à rechercher la possibilité d'appliquer les éditions les plus récentes des normes
indiquées ci-après. Les membres de la CEI et de l'ISO possèdent le registre des Normes internationales en vigueur
à un moment donné.
1)
ISO 6887-1:— , Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension mère et des dilutions
décimales en vue de l'examen microbiologique — Partie 1: Règles générales pour la préparation de la suspension
mère et des dilutions décimales.
ISO 7218:1996,
Microbiologie des aliments — Règles générales pour les examens microbiologiques.
ISO 11290-1:1996, Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche et le dénombrement de
Listeria monocytogenes — Partie 1: Méthode de recherche.
1) À publier. (Révision de l’ISO 6887:1993)
1
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ISO 11290-2:1998(F)
3 Définitions
Pour les besoins de la présente partie de l'ISO 11290, les définitions suivantes s'appliquent.
3.1
Listeria monocytogenes
micro-organismes qui forment des colonies typiques sur le milieu sélectif solide décrit et qui possèdent les
caractéristiques biochimiques, morphologiques et physiologiques décrites lorsque l'analyse est exécutée
conformément à la présente partie de l'ISO 11290
3.2
dénombrement des Listeria monocytogenes
détermination du nombre d'unités formant colonies (UFC) de Listeria monocytogenes (voir 3.1), dans une quantité
déterminée de produit, lorsque l'analyse est exécutée conformément à la présente partie de l'ISO 11290
4 Principe
Dans le cadre de la présente partie de l'ISO 11290, le dénombrement de Listeria monocytogenes nécessite six
étapes successives (voir à l’annexe A une représentation schématique du mode opératoire).
4.1 Préparation de la suspension mère dans l'un des deux diluants décrits, selon les besoins.
4.2 Revivification pendant 1 h à 20 °C.
4.3 Ensemencement en surface du milieu sélectif solide coulé dans deux boîtes de Petri, avec une quantité
déterminée de l’échantillon pour essai si le produit est liquide, ou de la suspension mère dans le cas d’autres
produits.
Dans les mêmes conditions, ensemencement des dilutions décimales obtenues à partir de l’échantillon pour essai
ou de la suspension mère.
4.4 Incubation des boîtes à 35 °C ou 37 °C et examen après 24 h et 48 h.
4.5 Confirmation des colonies présumées de Listeria monocytogenes au moyen des essais décrits.
4.6 À partir du nombre de colonies confirmées, calcul du nombre de Listeria monocytogenes par gramme ou par
millilitre de l'échantillon pour essai.
5 Milieux de culture et réactifs
Pour les pratiques courantes de laboratoire, voir l'ISO 7218.
NOTE En raison du nombre important de milieux de culture et de réactifs, il a été jugé préférable, pour la clarté du texte,
de les décrire dans l'annexe B.
6 Appareillage et verrerie
Matériel courant de laboratoire de microbiologie (voir l'ISO 7218) et, en particulier, ce qui suit.
6.1 Appareillage pour la stérilisation en chaleur sèche (four) ou en chaleur humide (autoclave)
Voir l’ISO 7218.
6.2 Enceinte de séchage ou étuve, pouvant être maintenue à une température entre 25 °C ± 1 °C et
50 °C ± 1 °C.
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6.3 Étuves, permettant de maintenir les milieux inoculés, les boîtes et les flacons à l'intérieur des plages de
températures suivantes:
a) 20 °C ± 1 °C (facultatif);
b) 25 °C ± 1 °C (facultatif);
c) 35 °C ± 1 °C ou 37 °C ± 1 °C.
6.4 Bain d'eau, réglable à 47 °C ± 2 °C.
6.5 Anses bouclées et fils droits en platine iridié ou en nickel-chrome, ou pipettes Pasteur ou anses bouclées
à usage unique.
6.6 Étaleurs en verre ou en matière plastique, stériles.
6.7 pH-mètre, ayant une précision de lecture de ± 0,01 unité pH à 25 °C, permettant de réaliser des mesures
précises à ± 0,1 unité pH.
6.8 Tubes à essai, flacons ou fioles, de capacités appropriées, pour la stérilisation et la conservation des milieux
de culture et l'incubation des milieux liquides.
6.9 Pipettes graduées à écoulement total, de 1 ml et 10 ml de capacité nominale, graduées respectivement en
0,1 ml et 0,5 ml.
6.10 Boîtes de Petri, de 90 mm et 140 mm de diamètre.
6.11 Jarres, pour l'incubation en atmosphère microaérophile (facultatif).
6.12 Mélange gazeux (facultatif), de composition spécifiée pour l'incubation en atmosphère microaérobie:
5 % à 12 % de CO , 5 % à 15 % de O et complément à 100 % de N .
2 2 2
6.13 Dispositif pour le test d'illumination de Henry (facultatif)
Voir l'annexe B.
6.14 Microscope, de préférence à contraste de phase.
7 Échantillonnage
L'échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente partie de l'ISO 11290. S'il n'existe
aucune Norme internationale spécifique à l'échantillonnage du produit concerné, il est recommandé que les parties
concernées se mettent d'accord à ce sujet.
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif, non endommagé ou modifié lors
du transport et de l'entreposage (voir l'ISO 7218).
8 Préparation de l'échantillon pour essai
Préparer l'échantillon pour essai conformément à la Norme internationale du produit concerné. S'il n'existe pas de
Norme internationale spécifique, il est recommandé que les parties concernées se mettent d'accord à ce sujet.
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9 Mode opératoire
AVERTISSEMENT — Lorsqu'un choix est laissé entre 35 °C et 37 °C pour la température d'incubation, cette
température doit faire l'objet d'un accord entre les parties intéressées et doit être indiquée dans le rapport
d'essai.
9.1 Prise d'essai, suspension mère et dilutions
Voir l'ISO 6887-1 et la Norme internationale spécifique traitant du produit concerné.
Utiliser comme diluant pour préparer la suspension mère soit l'eau peptonée tamponnée (B.1), soit le milieu de
base du bouillon Fraser-demi (B.2).
Le milieu de base du bouillon Fraser-demi, sans addition d'agents sélectifs, peut être utilisé comme diluant pour
le produit alimentaire si la méthode de recherche (voir l'ISO 11290-1) et la méthode de dénombrement sont
effectuées sur le même échantillon pour essai. Cette opération permet d'éviter la préparation de deux suspensions
mères; les agents sélectifs ne sont ajoutés à la suspension qu'après la prise d'essai pour dénombrement. Il
convient d'expliciter le recours à ce mode opératoire dans le rapport d'essai.
Laisser reposer la suspension mère pendant 1 h ± 5 min à 20 °C ± 2 °C [en utilisant, si nécessaire, l'étuve 6.3 a)]
afin de revivifier les micro-organismes stressés.
Si une gamme de dilutions est utilisée, la préparer après revivification.
9.2 Inoculation et incubation
9.2.1 Transférer, à l'aide d'une pipette stérile (6.9), 0,1 ml de la suspension mère (9.1) à la surface de chacune de
deux boîtes de gélose PALCAM (B.3) préalablement séchées si nécessaire à l'étuve (6.2).
Répéter l'opération avec les dilutions décimales suivantes si nécessaire.
NOTE S'il est nécessaire, pour certains produits, de procéder à l'estimation de petits nombres de , la
L. monocytogenes
limite du dénombrement peut être abaissée d'une puissance de 10, en examinant 1,0 ml de la suspension mère. Répartir 1 ml
de l'inoculum avec un étaleur stérile (6.6), soit à la surface du milieu gélosé coulé dans une grande boîte de Petri (140 mm),
soit à la surface du milieu gélosé coulé dans trois petites boîtes de Petri (90 mm). Dans les deux cas, effectuer ces opérations
en double, de façon à avoir deux grandes boîtes ou six petites boîtes.
9.2.2 Étaler soigneusement l'inoculum le plus rapidement possible à la surface du milieu en évitant de toucher les
2)
bords de la boîte avec l'étaleur. Utiliser un étaleur stérile pour chaque boîte. Laisser les boîtes fermées pendant
environ 15 min à la température ambiante pour permettre à l'inoculum d'être absorbé dans la gélose.
9.2.3 Retourner les boîtes préparées en 9.2.2 et les placer dans une étuve [6.3 c)] réglée à 35 °C ou 37 °C.
Incuber les boîtes de gélose PALCAM, soit en atmosphère microaérobie dans une jarre (6.11) contenant le
mélange gazeux (6.12), soit en atmosphère aérobie.
9.3 Dénombrement des colonies caractéristiques
9.3.1 Après incubation pendant 24 h, et 18 h à 24 h supplémentaires si le développement est faible ou si aucune
colonie n'est observée après 24 h d'incubation, examiner les boîtes (9.2.3) afin de rechercher la présence de
colonies présumées être des Listeria spp. (voir 9.3.3).
9.3.2 Dans le cas d'une incubation en atmosphère microaérobie, après incubation, laisser la gélose retrouver sa
couleur pourpre en laissant les boîtes de gélose PALCAM (9.3.1) à l'air libre pendant 1 h.
9.3.3 Après 24 h, les colonies caractéristiques de Listeria spp. se présentent sous forme de petites ou très petites
colonies vertes avec des reflets grisâtres, ou vert olive, avec parfois un centre noir mais toujours entourées d'un
2) Il est possible d'utiliser le même étaleur pour un même échantillon, en commençant par la dilution la plus forte.
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halo noir. Après 48 h, les Listeria spp. se présentent sous forme de colonies vertes de 1,5 mm à 2 mm de diamètre,
avec une dépression centrale, et entourées d'un halo noir.
9.3.4 Compter toutes les colonies présumées être des Listeria spp. (9.3.3) pour chaque boîte contenant moins de
150 colonies caractéristiques ou non caractéristiques.
9.4 Confirmation du genre Listeria spp.
9.4.1 Sélection des colonies pour la confirmation
9.4.1.1 Après la période d'incubation (9.3.1), retenir les boîtes contenant au maximum 150 colonies présumées
être des Listeria spp., à toutes les dilutions et, si possible, au niveau de deux dilutions successives.
Sélectionner cinq colonies présumées sur chaque boîte retenue. Si une boîte présente moins de cinq colonies
présumées, sélectionner pour la confirmation toutes les colonies présumées.
9.4.1.2 Ensemencer en stries les colonies sélectionnées sur la surface des boîtes de gélose à la tryptone de soja
et à l'extrait de levure (TSYEA) (B.4), préalablement séchées, de façon à permettre le développement de colonies
bien isolées.
Placer les boîtes dans l'étuve [6.3 c)] réglée à 35 °C ou 37 °C pendant 18 h à 24 h ou jusqu'à un développement
satisfaisant.
Les colonies typiques, de 1 mm à 2 mm de diamètre, sont convexes, incolores, translucides et à bords réguliers. Si
les colonies ne sont pas bien isolées, repiquer une colonie typique de Listeria spp. sur une nouvelle boîte de
TSYEA. Effectuer les essais suivants à partir de colonies d'une culture pure sur TSYEA.
NOTE Le test d'illumination de Henry peut être réalisé si nécessaire (voir l'annexe C et la note en B.4.2). Les colonies
apparaissent alors bleuâtres avec une surface granuleuse.
9.4.2 Réaction de la catalase
Prélever une colonie isolée en 9.4.1.2 et la mettre en suspension sur une lame dans une goutte de la solution de
peroxyde d'hydrogène (B.10). La formation de bulles indique une réaction positive (voir l'ISO 7218).
9.4.3 Coloration de Gram
Effectuer une coloration de Gram d'une colonie isolée en 9.4.1.2 (voir l'ISO 7218). Les spp. apparaissent
Listeria
sous forme de petits et minces bacilles Gram positif (d'environ 0,4 μm à 0,5 μm de diamètre et 1 μm à 2 μm de
longueur).
3)
9.4.4 Examen de la mobilité (si nécessaire)
Prélever une colonie isolée en 9.4.1.2 et la mettre en suspension dans un tube contenant le bouillon TSYEB (B.5).
Incuber à l'étuve [6.3 b)] à 25 °C pendant 8 h à 24 h, jusqu'à ce qu'un trouble soit observé.
Déposer une goutte de la culture précédente, à l'aide d'une anse bouclée (6.5), sur une lame propre de microscope
et examiner au microscope (6.14) entre lame et lamelle. Les Listeria spp. apparaissent sous forme de bacilles
minces et courts, et sont animées d'une mobilité en «pirouette».
Ce type de phénomène n'est parfois pas constaté pour les cultures développées à une température supérieure à
25 °C. Comparer toujours le résultat avec une culture connue. Les coques, les bacilles longs ou les bacilles qui se
déplacent rapidement ne sont pas des Listeria spp.
3) Cet examen n'est pas nécessaire dans tous les cas si l'analyse est effectuée par un microbiologiste pratiquant régulièrement
la recherche de L. monocytogenes.
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En alternative, il est également possible d'examiner la mobilité, en ensemençant par piqûre avec le fil droit (6.5) la
gélose mobilité (B.8) à partir d'une colonie typique sur gélose TSYEA (9.4.1.2). Incuber à l'étuve [6.3 b)] à 25 °C
pendant 48 h.
Examiner le développement autour de la piqûre. Les Listeria spp. sont mobiles et donnent une culture typique en
forme de parapluie immédiatement sous la surface de la gélose. Si la culture n'est pas suffisante, incuber jusqu'à
5 jours supplémentaires et examiner la culture pendant ce temps.
9.5 Confirmation de l'espèce L. monocytogenes
9.5.1 Recherche de l'hémolyse
9.5.1.1 Si les caractéristiques morphologiques et physiologiques, ainsi que la réaction de la catalase, indiquent la
présence éventuelle de Listeria spp., observer la réaction hémolytique sur les boîtes de gélose au sang de mouton
(B.6).
Avant l'emploi, sécher soigneusement la surface de la gélose au sang, tracer ensuite un quadrillage sur la gélose.
Pour chaque culture, prélever une colonie isolée en 9.4.1.2 et inoculer, par piqûre à l’aide d’un fil droit (6.5), un
carré délimité. Inoculer également par piqûre à l'aide d'un fil droit (6.5) les cultures témoins positif (L. mono-
cytogenes) et négatif (L. innocua).
Après incubation à 35 °C ou 37 °C pendant 24 h ± 2 h, examiner les souches d'essai et les souches témoins. Les
4)
L. monocytogenes montrent des zones étroites, claires et légères de ß-hémolyse . On n'observe pas de zone
claire autour de la piqûre pour les L. innocua. Les L. seeligeri montrent une faible zone d'hémolyse. Les L. ivanovii
forment habituellement de larges zones de ß-hémolyse nettement délimitées. Examiner les boîtes par transparence
pour comparer les cultures d'essai et les témoins.
9.5.1.2 La réaction hémolytique peut également être déterminée par le test de CAMP (9.5.3), ou en utilisant des
hématies en suspension comme suit. Émulsionner la colonie dans 150 μl de bouillon TSYEB (B.5); incuber à 35 °C
ou 37 °C pendant 2 h. Ajouter 150 μl de suspension d'hématies de sang de mouton (B.12). Incuber à 35 °C ou
37 °C pendant 15 min à 60 min, puis refroidir à 3 °C ± 2 °C pendant 2 h environ. Examiner alors la présence ou
l'absence de ß-hémolyse. Si la réaction e
...
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