ISO 10272-1:2006
(Main)Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for detection and enumeration of Campylobacter spp. — Part 1: Detection method
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for detection and enumeration of Campylobacter spp. — Part 1: Detection method
ISO 10272-1:2006 describes a horizontal method for the detection of Campylobacter spp. It is applicable to products intended for human consumption or for the feeding of animals, and to environmental samples in the area of food production and food handling, subject to the limitations stated in the Introduction.
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche et le dénombrement de Campylobacter spp. — Partie 1: Méthode de recherche
L'ISO 10272-1:2006 décrit une méthode horizontale pour la recherche de Campylobacter spp. Sous réserve de certaines restrictions (exposées dans l'introduction), elle est applicable aux produits destinés à la consommation humaine ou à l'alimentation des animaux, ainsi qu'aux échantillons environnementaux prélevés dans les secteurs de la production et de la manutention des aliments.
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INTERNATIONAL ISO
STANDARD 10272-1
First edition
2006-01-15
Microbiology of food and animal
feeding stuffs — Horizontal method for
detection and enumeration of
Campylobacter spp. —
Part 1:
Detection method
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la recherche et
le dénombrement de Campylobacter spp. —
Partie 1: Méthode de recherche
Reference number
ISO 10272-1:2006(E)
©
ISO 2006
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ISO 10272-1:2006(E)
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ISO 10272-1:2006(E)
Contents Page
Foreword. iv
Introduction . v
1 Scope .1
2 Normative references .1
3 Terms and definitions .1
4 Principle.2
5 Culture media and reagents .2
6 Apparatus and glassware .3
7 Sampling.4
8 Preparation of test sample.4
9 Procedure (see diagram in Annex A) .5
10 Expression of results .8
11 Test report .8
Annex A (normative) Diagram of procedure .9
Annex B (normative) Composition and preparation of culture media and reagents .10
Bibliography .16
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ISO 10272-1:2006(E)
Foreword
ISO (the International Organization for Standardization) is a worldwide federation of national standards bodies
(ISO member bodies). The work of preparing International Standards is normally carried out through ISO
technical committees. Each member body interested in a subject for which a technical committee has been
established has the right to be represented on that committee. International organizations, governmental and
non-governmental, in liaison with ISO, also take part in the work. ISO collaborates closely with the
International Electrotechnical Commission (IEC) on all matters of electrotechnical standardization.
International Standards are drafted in accordance with the rules given in the ISO/IEC Directives, Part 2.
The main task of technical committees is to prepare International Standards. Draft International Standards
adopted by the technical committees are circulated to the member bodies for voting. Publication as an
International Standard requires approval by at least 75 % of the member bodies casting a vote.
Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent
rights. ISO shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights.
ISO 10272-1 was prepared by Technical Committee ISO/TC 34, Food products, Subcommittee SC 9,
Microbiology.
This first edition of ISO 10272-1, together with ISO/TS 10272-2:2006, cancels and replaces ISO 10272:1995,
which has been technically revised.
ISO 10272 consists of the following parts, under the general title Microbiology of food and animal feeding
stuffs — Horizontal method for detection and enumeration of Campylobacter spp.:
⎯ Part 1: Detection method
⎯ Part 2: Colony-count technique (Technical Specification)
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ISO 10272-1:2006(E)
Introduction
Because of the large variety of food and feed products, this horizontal method may not be appropriate in every
detail for certain products, and for some other products it may be necessary to use different methods.
Nevertheless, it is hoped that in all cases every attempt will be made to apply this horizontal method as far as
possible and that deviations from this will only be made if absolutely necessary for technical reasons.
When this International Standard is next reviewed, account will be taken of all information then available
regarding the extent to which this horizontal method has been followed and the reasons for deviations from
this in the case of particular products. The harmonization of test methods cannot be immediate and, for certain
group of products, International Standards and/or national standards may already exist that do not comply
with this horizontal method. It is hoped that when such standards are reviewed, they will be changed to
comply with this International Standard so that eventually the only remaining departures from this horizontal
method will be those necessary for well-established technical reasons.
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INTERNATIONAL STANDARD ISO 10272-1:2006(E)
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal
method for detection and enumeration of Campylobacter
spp. —
Part 1:
Detection method
1 Scope
This part of ISO 10272 describes a horizontal method for the detection of Campylobacter spp.
It is applicable to products intended for human consumption or for the feeding of animals, and to
environmental samples in the area of food production and food handling, subject to the limitations stated in the
Introduction.
2 Normative references
The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated
references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced
document (including any amendments) applies.
ISO 6887 (all parts), Microbiology of food and animal feeding stuffs — Preparation of test samples, initial
suspension and decimal dilutions for microbiological examination
ISO 7218, Microbiology of food and animal feeding stuffs — General rules for microbiological examinations
ISO 8261, Milk and milk products — General guidance for the preparation of test samples, initial suspensions
and decimal dilutions for microbiological examinations
ISO/TS 11133-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Guidelines on preparation and production
of culture media — Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the
laboratory
ISO/TS 11133-2:2003, Microbiology of food and animal feeding stuffs — Guidelines on preparation and
production of culture media — Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media
3 Terms and definitions
For the purposes of this document, the following terms and definitions apply.
3.1
Campylobacter
microorganisms forming characteristic colonies on solid selective media when incubated microaerobically at
41,5 °C but not at 25 °C, and which possess the characteristic motility and biochemical and growth properties
described when the tests are conducted in accordance with this part of ISO 10272
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ISO 10272-1:2006(E)
NOTE The most frequently encountered species are Campylobacter jejuni and Campylobacter coli. Other species
have, however, been described (Campylobacter lari, Campylobacter upsaliensis and some others).
3.2
detection of Campylobacter
determination of the presence or absence of these microorganisms in a defined quantity of product, when the
test is conducted in accordance with this part of ISO 10272
4 Principle
4.1 General
In general, the detection of Campylobacter requires the following stages (see Annex A for a diagram of the
procedure).
4.2 Enrichment in selective liquid medium
The test portion is inoculated into the liquid enrichment medium (Bolton broth) and homogenized.
It is incubated in a microaerobic atmosphere at 37 °C for 4 h to 6 h and then at 41,5 °C for 44 h ± 4 h.
4.3 Isolation and selection for confirmation
From the cultures obtained in 4.2, two selective solid media are inoculated:
⎯ modified charcoal cefoperazone deoxycholate agar (mCCD agar);
⎯ any other solid selective medium based on a principle different from that of mCCD agar.
They are then incubated at 41,5 °C in a microaerobic atmosphere and inspected after 44 h ± 4 h to detect the
presence of colonies presumed because of their characteristics to be Campylobacter.
4.4 Confirmation
The colonies presumed to be Campylobacter are subcultured on the non-selective Columbia blood agar, then
confirmed by means of microscopic examination and appropriate biochemical and growth tests. Optionally, the
Campylobacter species are identified by specific biochemical tests and antibiotic sensitivity tests.
5 Culture media and reagents
5.1 General
For current laboratory practice, see ISO 7218, ISO/TS 11133-1 and ISO/TS 11133-2.
NOTE Because of the large number of culture media and reagents and for the clarity of the text, their compositions
and preparations are given in Annex B.
5.2 Liquid enrichment medium: Bolton broth
See B.1.
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ISO 10272-1:2006(E)
5.3 Selective plating medium: Modified charcoal cefoperazone deoxycholate agar (mCCD
agar)
See B.2.
5.4 Confirmation and identification media and reagents
5.4.1 Columbia blood agar
See B.3.
5.4.2 Brucella broth
See B.4.
5.4.3 Reagent for the detection of oxidase
See B.5.
5.4.4 Hydrogen peroxide solution, 3 % (volume fraction)
5.4.5 Reagents for the detection of hydrolysis of hippurate
See B.6.
5.4.6 Mueller Hinton blood agar
See B.7.
5.4.7 Nalidixic acid (30 µg) and cephalothin (30 µg) discs
5.4.8 Indoxyl acetate discs
See B.8.
6 Apparatus and glassware
Usual microbiological laboratory equipment (see ISO 7218) and, in particular, the following.
6.1 Apparatus for dry sterilization (oven) or wet sterilization (autoclave)
See ISO 7218.
6.2 Oven, laminar flow cabinet or incubator, capable of operating between 37 °C and 55 °C.
6.3 Incubator, capable of operating at 41,5 °C ± 1 °C.
6.4 Water baths, capable of operating at 25 °C ± 1 °C and 37 °C ± 1 °C, or incubators capable of operating
at 25 °C ± 1 °C and 37 °C ± 1 °C.
6.5 Water bath, capable of operating between 47 °C and 50 °C.
6.6 pH-meter, accurate to within 0,1 pH units at 25 °C.
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ISO 10272-1:2006(E)
6.7 Containers, in particular culture tubes of dimensions 18 mm × 180 mm and 9 mm × 180 mm,
haemolysis tubes of dimensions 13 mm × 75 mm, bottles with non-toxic metal closures and/or flasks of
appropriate capacity with appropriate covers.
6.8 Petri dishes, in glass or plastic, with diameters 90 mm to 100 mm.
6.9 Total-delivery graduated pipettes, with a wide opening, and a nominal capacity of 1 ml and 10 ml,
graduated in 0,1 ml divisions, and Pasteur pipettes.
6.10 Rubber teats, or any other safety system capable of being adapted to the graduated pipettes.
6.11 Sterile loops, of platinum/iridium, nickel/chromium or plastic, approximately 3 mm in diameter, and
wires of the same material, or a glass or plastic rod.
A nickel/chromium loop is not suitable for use in the oxidase test (see 9.4.6).
6.12 Forceps, fine, round-ended, of stainless steel.
6.13 Microscope, preferably with phase contrast (for observing the characteristic motility of Campylobacter).
6.14 Apparatus suitable for achieving a microaerobic atmosphere with oxygen content of 5 % ± 2 %,
carbon dioxide 10 % ± 3 %, optional hydrogen u 10 %, with the balance nitrogen. Appropriate gastight
containers are used to hold Petri dishes and/or flasks or bottles of about 350 ml capacity used for the
enrichment broth, e.g. bacteriological anaerobic jars.
NOTE 1 The appropriate microaerobic atmosphere can be obtained using commercially available gas-generating kits,
following precisely the manufacturer's instructions, particularly those relating to the volume of the jar and the capacity of
the gas-generating kit. Alternatively, the jar may be filled with an appropriate gas mixture prior to incubation.
NOTE 2 As an alternative to incubation in a microaerobic atmosphere, the enrichment broth can be incubated in screw-
capped bottles or flasks filled with enrichment broth, leaving a headspace of less than 2 cm, and tightly closing the caps.
7 Sampling
It is important that the laboratory receive a sample which is truly representative and has not been damaged or
changed during transport or storage.
Sampling is not part of the method specified in this part of ISO 10272. See the specific International Standard
dealing with the product concerned. If there is no specific International Standard dealing with sampling of the
product concerned, it is recommended that the parties concerned come to an agreement on this subject.
Since Campylobacter spp. are very sensitive to freezing but survive best at low temperatures, it is
recommended that samples to be tested should not be frozen, but stored at +3 °C ± 2 °C and subjected to
analysis as rapidly as possible. Also take care to prevent the samples from drying.
8 Preparation of test sample
Prepare the test sample in accordance with the specific International Standard dealing with the product
concerned. If there is no specific International Standard, it is recommended that the parties concerned come
to an agreement on this subject.
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ISO 10272-1:2006(E)
9 Procedure (see diagram in Annex A)
9.1 Test portion, initial suspension and dilutions
9.1.1 See the suitable part of ISO 6887, or ISO 8261.
9.1.2 In general, for preparing the initial suspension, introduce a quantity x of the test portion (mass or
volume) into nine times its volume of the enrichment medium Bolton broth (5.2), so as to obtain a test
portion/enrichment medium ratio of 1:10 (mass/volume or volume/volume), and homogenize.
9.2 Enrichment
Incubate the initial suspension (9.1.2) in a microaerobic atmosphere (6.14) at 37 °C for 4 h to 6 h, then at
41,5 °C for 44 h ± 4 h.
9.3 Isolation
9.3.1 Using the culture obtained in the enrichment medium (9.2), inoculate with a sterile loop (6.11) the
surface of the first selective isolation medium, mCCD agar (5.3).
Proceed in the same manner with the second Campylobacter selective isolation medium chosen.
NOTE It is preferable to take a second isolation medium that is based on a principle different from mCCD agar.
Examples of isolation media to be used are Skirrow agar, Karmali agar and Preston agar (see Bibliography).
9.3.2 Incubate the plates (9.3.1) at 41,5 °C in a microaerobic atmosphere (6.14).
9.3.3 After 44 h ± 4 h of incubation, examine the plates for typical and/or suspect colonies of
Campylobacter.
The typical colonies are greyish on mCCD agar, often with a metallic sheen, and are flat and moist, with a
tendency to spread. Colonies spread less on drier agar surfaces. Other forms of colonies may occur.
9.4 Confirmation of Campylobacter species
9.4.1 General
As the bacteria rapidly deteriorate in air, follow the procedure described in 9.4.2 to 9.4.6 without any delay.
9.4.2 Selection of colonies for confirmation
9.4.2.1 For confirmation, take from each plate of each selective medium (9.3.1) at least one colony
considered to be typical or suspected as being Campylobacter and a further four colonies if the first is
negative.
9.4.2.2 Streak each of the selected colonies onto a Columbia blood agar plate (5.4.1) in order to allow the
development of well-isolated
...
NORME ISO
INTERNATIONALE 10272-1
Première édition
2006-01-15
Microbiologie des aliments —
Méthode horizontale pour
la recherche et le dénombrement
de Campylobacter spp. —
Partie 1:
Méthode de recherche
Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for
detection and enumeration of Campylobacter spp. —
Part 1: Detection method
Numéro de référence
ISO 10272-1:2006(F)
©
ISO 2006
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ISO 10272-1:2006(F)
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Publié en Suisse
ii © ISO 2006 – Tous droits réservés
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ISO 10272-1:2006(F)
Sommaire Page
Avant-propos. iv
Introduction . v
1 Domaine d'application.1
2 Références normatives .1
3 Termes et définitions.2
4 Principe.2
5 Milieux de culture et réactifs .3
6 Appareillage et verrerie.4
7 Échantillonnage .5
8 Préparation de l’échantillon pour essai .5
9 Mode opératoire (voir sa représentation schématique à l’Annexe A).5
10 Expression des résultats .9
11 Rapport d’essai.9
Annexe A (normative) Représentation schématique du mode opératoire.10
Annexe B (normative) Composition et préparation des milieux de culture et des réactifs .11
Bibliographie .18
© ISO 2006 – Tous droits réservés iii
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ISO 10272-1:2006(F)
Avant-propos
L'ISO (Organisation internationale de normalisation) est une fédération mondiale d'organismes nationaux de
normalisation (comités membres de l'ISO). L'élaboration des Normes internationales est en général confiée
aux comités techniques de l'ISO. Chaque comité membre intéressé par une étude a le droit de faire partie du
comité technique créé à cet effet. Les organisations internationales, gouvernementales et non
gouvernementales, en liaison avec l'ISO participent également aux travaux. L'ISO collabore étroitement avec
la Commission électrotechnique internationale (CEI) en ce qui concerne la normalisation électrotechnique.
Les Normes internationales sont rédigées conformément aux règles données dans les Directives ISO/CEI,
Partie 2.
La tâche principale des comités techniques est d'élaborer les Normes internationales. Les projets de Normes
internationales adoptés par les comités techniques sont soumis aux comités membres pour vote. Leur
publication comme Normes internationales requiert l'approbation de 75 % au moins des comités membres
votants.
L'attention est appelée sur le fait que certains des éléments du présent document peuvent faire l'objet de
droits de propriété intellectuelle ou de droits analogues. L'ISO ne saurait être tenue pour responsable de ne
pas avoir identifié de tels droits de propriété et averti de leur existence.
L'ISO 10272-1 a été élaborée par le comité technique ISO/TC 34, Produits alimentaires, sous-comité SC 9,
Microbiologie.
Cette première édition de l'ISO 10272-1, ainsi que l'ISO/TS 10272-2:2006, annule et remplace
l'ISO 10272:1995, qui fait l'objet d'une révision technique.
L'ISO 10272 comprend les parties suivantes, présentées sous le titre général Microbiologie des aliments —
Méthode horizontale pour la recherche et le dénombrement de Campylobacter spp.:
⎯ Partie 1: Méthode de recherche
⎯ Partie 2: Méthode de dénombrement (Spécification technique)
iv © ISO 2006 – Tous droits réservés
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ISO 10272-1:2006(F)
Introduction
En raison de la grande diversité des produits alimentaires, il est possible que la présente méthode horizontale
ne convienne pas exactement, dans tous ses détails, à certains produits et que, pour certains autres produits,
il soit nécessaire d’employer d’autres méthodes. Néanmoins, il est à espérer que tous les efforts seront
entrepris dans tous les cas afin d’appliquer, dans la mesure du possible, la présente méthode horizontale et
qu’il n’y aura d’écarts par rapport à la présente méthode qu’en cas d’absolue nécessité et pour des raisons
techniques.
À la prochaine révision de la présente Norme internationale, il sera tenu compte de tous les renseignements
disponibles à ce moment-là sur l'ampleur avec laquelle la présente méthode horizontale aura été suivie et les
raisons pour lesquelles il aura été nécessaire d'y déroger dans le cas de produits particuliers. L’harmonisation
des méthodes d’essai ne peut être instantanée et, pour certains groupes de produits, des Normes
internationales et/ou nationales ne concordant pas avec la présente méthode horizontale existent peut-être
déjà. Lors de la révision de telles normes, il serait souhaitable de les aligner sur la présente Norme
internationale de sorte qu’à terme les seules divergences restantes se limiteront à celles qui sont nécessaires
pour des raisons techniques bien établies.
© ISO 2006 – Tous droits réservés v
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NORME INTERNATIONALE ISO 10272-1:2006(F)
Microbiologie des aliments — Méthode horizontale pour la
recherche et le dénombrement de Campylobacter spp. —
Partie 1:
Méthode de recherche
1 Domaine d'application
La présente partie de l’ISO 10272 décrit une méthode horizontale pour la recherche de Campylobacter spp.
Sous réserve des restrictions exposées dans l’introduction, elle est applicable aux produits destinés à la
consommation humaine ou à l’alimentation des animaux, ainsi qu’aux échantillons environnementaux
prélevés dans les secteurs de la production et de la manutention des aliments.
2 Références normatives
Les documents de référence suivants sont indispensables pour l'application du présent document. Pour les
références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées, la dernière édition du
document de référence s'applique (y compris les éventuels amendements).
ISO 6887 (toutes les parties) Microbiologie des aliments — Préparation des échantillons, de la suspension
mère et des dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique
ISO 7218, Microbiologie des aliments — Règles générales pour les examens microbiologiques
ISO 8261, Lait et produits laitiers — Lignes directrices générales pour la préparation des échantillons pour
essai, de la suspension mère et des dilutions décimales en vue de l'examen microbiologique
ISO/TS 11133-1, Microbiologie des aliments — Guide pour la préparation et la production des milieux de
culture — Partie 1: Guide général pour l'assurance de la qualité pour la préparation des milieux de culture en
laboratoire
ISO/TS 11133-2:2003, Microbiologie des aliments — Guide pour la préparation et la production des milieux de
culture — Partie 2: Guide général pour les essais de performance des milieux de culture
© ISO 2006 – Tous droits réservés 1
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ISO 10272-1:2006(F)
3 Termes et définitions
Pour les besoins du présent document, les termes et définitions suivants s'appliquent.
3.1
Campylobacter
microorganismes formant des colonies caractéristiques sur des milieux sélectifs solides lorsqu’ils sont incubés
à 41,5 °C (mais non à 25 °C) en atmosphère microaérophile et possédant la mobilité caractéristique et les
propriétés biochimiques décrites lorsque l’essai est réalisé conformément à la présente partie de l’ISO 10272
NOTE Les espèces le plus souvent rencontrées sont Campylobacter jejuni et Campylobacter coli. D’autres espèces
ont toutefois été décrites (Campylobacter lari, Campylobacter upsaliensis et quelques autres).
3.2
recherche des Campylobacter
détermination de la présence ou de l’absence de ces microorganismes dans une quantité déterminée de
produit, lorsque l’essai est exécuté conformément à la présente partie de l’ISO 10272
4 Principe
4.1 Généralités
La recherche de Campylobacter nécessite en général les étapes suivantes (voir l’Annexe A pour une
représentation schématique du mode opératoire).
4.2 Enrichissement en milieu sélectif liquide
Ensemencement de la prise d’essai dans le bouillon d’enrichissement de Bolton et homogénéisation.
Incubation en atmosphère microaérophile à 37 °C pendant 4 h à 6 h, puis à 41,5 °C pendant 44 h ± 4 h.
4.3 Isolement et sélection pour confirmation
À partir des cultures obtenues en 4.2, deux milieux sélectifs solides sont ensemencés:
⎯ une gélose modifiée à la céfopérazone, au charbon et au désoxycholate (gélose mCCD);
⎯ un autre milieu sélectif solide basé sur un principe différent de celui du mCCD.
Incubation à 41,5 °C en atmosphère microaérophile et observation au bout de 44 h ± 4 h, afin de détecter la
présence de colonies présumées de Campylobacter selon leurs caractéristiques.
4.4 Confirmation
Repiquage des colonies présumées de Campylobacter sur un milieu non sélectif (gélose Columbia au sang),
puis confirmation par examens microscopiques et essais biochimiques et de croissance appropriés.
Éventuellement, identification de l’espèce de Campylobacter par des essais biochimiques spécifiques et une
recherche de sensibilité aux antibiotiques.
2 © ISO 2006 – Tous droits réservés
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ISO 10272-1:2006(F)
5 Milieux de culture et réactifs
5.1 Généralités
Pour les pratiques courantes de laboratoire, voir l’ISO 7218, l’ISO/TS 11133-1 et l’ISO/TS 11133-2.
NOTE En raison du nombre important de milieux de culture et de réactifs, il a été jugé préférable, pour la clarté du
texte, de donner leur composition et leur préparation à l’Annexe B.
5.2 Milieu d’enrichissement liquide: le bouillon de Bolton
Voir B.1.
5.3 Milieu d’isolement sélectif: gélose modifiée à la céfopérazone, au charbon et au
désoxycholate (gélose mCCD)
Voir B.2.
5.4 Milieux et réactifs de confirmation et d’identification
5.4.1 Gélose Columbia au sang
Voir B.3.
5.4.2 Bouillon Brucella
Voir B.4.
5.4.3 Réactif pour la recherche de l’oxydase
Voir B.5.
5.4.4 Solution de peroxyde d’hydrogène, à 3 % (fraction volumique)
5.4.5 Réactifs pour la recherche de l’hydrolyse de l’hippurate
Voir B.6.
5.4.6 Gélose Mueller Hinton au sang
Voir B.7.
5.4.7 Disques imprégnés d’acide nalidixique (30 µg) et de céfalotine (30 µg)
5.4.8 Disques imprégnés d’acétate d’indoxyle
Voir B.8.
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ISO 10272-1:2006(F)
6 Appareillage et verrerie
Matériel courant de laboratoire de microbiologie (voir l’ISO 7218) et en particulier ce qui suit.
6.1 Appareil de stérilisation par chaleur sèche (four) ou humide (autoclave)
Voir l’ISO 7218.
6.2 Enceinte de séchage ou étuve, ventilée par convection, réglable entre 37 °C et 55 °C.
6.3 Étuve, réglable à 41,5 °C ± 1 °C.
6.4 Bains d’eau, réglables entre 25 °C ± 1 °C et 37 °C ± 1 °C, ou étuves réglables à 25 °C ± 1 °C et
37 °C ± 1 °C.
6.5 Bains d’eau, réglables entre 47 °C et 50 °C.
6.6 pH-mètre, d’une précision de 0,1 unité de pH à 25 °C.
6.7 Récipients, notamment des tubes à essai de 18 mm × 180 mm et de 9 mm × 180 mm pour la mise en
culture, des tubes à hémolyse de 13 mm × 75 mm, des flacons se fermant avec un bouchon métallique non
toxique et/ou des fioles de capacité appropriée, munis de fermetures appropriées.
6.8 Boîtes de Petri, en verre ou en plastique, de 90 mm à 100 mm de diamètre.
6.9 Pipettes graduées à écoulement total, à large ouverture et de capacité nominale de 1 ml et de 10 ml,
graduées en divisions de 0,1 ml, et pipettes Pasteur.
6.10 Poires en caoutchouc, ou tout autre système de sécurité pouvant s’adapter sur les pipettes graduées.
6.11 Anses stériles, en platine iridié, en nickel-chrome ou en plastique, d’environ 3 mm de diamètre, et fils
droits constitués des mêmes matériaux, ou une baguette en verre ou en plastique.
Ne pas utiliser une anse en nickel-chrome pour l’essai de recherche de l’oxydase (voir 9.4.6).
6.12 Pinces, fines, à bouts ronds, en acier inoxydable.
6.13 Microscope, de préférence à contraste de phase, pour observer le mouvement caractéristique des
Campylobacter.
6.14 Appareillage approprié à la culture en atmosphère microaérophile, permettant de maintenir tout au
long de l’incubation une teneur constante de 5 % ± 2 % en oxygène, de 10 % ± 3 % en dioxyde de carbone,
de u 10 % en hydrogène (facultatif) et le complément en azote. Utiliser des récipients appropriés, étanches
aux gaz, pouvant recevoir les boîtes de Petri et/ou les flacons ou les fioles d’une capacité d’environ 350 ml
utilisés pour le milieu d’enrichissement, par exemple des jarres anaérobies.
NOTE 1 Une atmosphère microaérophile appropriée peut être obtenue en utilisant des sachets générateurs de gaz
disponibles dans le commerce (suivre rigoureusement les instructions du fabricant, en particulier celles relatives au
volume de la jarre et à la capacité du générateur). Alternativement, il est possible d’injecter dans la jarre, avant
l’incubation, un mélange gazeux avec les proportions des différents gaz appropriés.
NOTE 2 Au lieu d’incuber le milieu d’enrichissement dans une atmosphère microaérophile, il est également possible
d’incuber dans des flacons ou des fioles à bouchon à vis, qui ont été remplis de milieu d’enrichissement en laissant un
espace vide de moins de 2 cm, et dont le bouchon est hermétiquement vissé.
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7 Échantillonnage
Il est important que le laboratoire reçoive un échantillon réellement représentatif, non endommagé ni modifié
lors du transport ou de l’entreposage.
L’échantillonnage ne fait pas partie de la méthode spécifiée dans la présente partie de l’ISO 10272. Voir la
Norme internationale spécifique du produit concerné. S’il n’y a pas de Norme internationale spécifique traitant
de l’échantillonnage du produit concerné, il est recommandé que les parties concernées se mettent d’accord à
ce sujet.
Étant donné que les Campylobacter spp. sont très sensibles à la congélation, mais qu'ils survivent bien à
basse température, il est recommandé de ne pas congeler les échantillons à examiner, mais de les conserver
à + 3 °C ± 2 °C et de les analyser le plus rapidement possible. Par ailleurs, prendre garde à prévenir la
déshydratation des échantillons.
8 Préparation de l’échantillon pour essai
Préparer l’échantillon pour essai conformément à la Norme internationale spécifique du produit concerné. S’il
n’y a pas de Norme internationale spécifique, il est recommandé que les parties concernées se mettent
d’accord à ce sujet.
9 Mode opératoire (voir sa représentation schématique à l’Annexe A)
9.1 Prise d’essai, suspension mère et dilutions
9.1.1 Voir l’ISO 6887 et l'ISO 8261.
9.1.2 En général, pour préparer la suspension mère, introduire une quantité x de la prise d’essai (en masse
ou en volume) dans neuf fois (en masse ou en volume) de milieu d’enrichissement, à savoir le bouillon de
Bolton (5.2), de façon à obtenir un rapport de la prise d’essai au milieu d’enrichissement de 1:10 (masse ou
volume/masse ou volume), et homogénéiser.
9.2 Enrichissement
Incuber la suspension mère (9.1.2) en atmosphère microaérophile (6.14) à 37 °C pendant 4 h à 6 h, puis à
41,5 °C pendant 44 h ± 4 h.
9.3 Isolement
9.3.1 Utiliser la culture obtenue dans le milieu d’enrichissement (9.2) pour ensemencer à l’aide d’une anse
stérile (6.11) la surface du premier milieu d’isolement sélectif, c’est-à-dire de la gélose mCCD (5.3).
Procéder de même avec le second milieu sélectif d’isolement choisi.
NOTE Il est préférable de choisir un deuxième milieu d'isolement basé sur un principe différent de celui de la gélose
mCCD. Les milieux suivants peuvent être utilisés, par exemple: gélose Skirrow, gélose Karmali et gélose Preston (voir la
Bibliographie).
9.3.2 Incuber les boîtes (9.3.1) à 41,5 °C en atmosphère microaérophile (6.14).
9.3.3 Après 44 h ± 4 h d’incubation, examiner les boîtes afin de rechercher la présence de colonies
caractéristiques et/ou suspectes de Campylobacter.
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Sur la gélose mCCD, les colonies caractéristiques sont grisâtres, souvent avec un reflet métallique, plates et
humides, avec une tendance à s’étaler. Les colonies s'étalent moins sur des surfaces de gélose plus sèches.
D'autres formes de colonies peuvent apparaître.
9.4 Confirmation de l’espèce Campylobacter
9.4.1 Généralités
Les bactéries s’altérant rapidement à l’air libre, suivre sans tarder le mode opératoire décrit de 9.4.2 à 9.4.6.
9.4.2 Sélection des colonies à confirmer
9.4.2.1 Pour les essais de confirmation, sélectionner au moins une colonie caractéristique et/ou suspecte
de chaque boîte de milieu sélectif ensemencées (9.3.1) et quatre colonies supplémentaires si la première est
négative.
9.4.2.2 Ensemencer chacune des colonies sélectionnées sur la gélose Columbia au sang (5.4.1) de
façon à obtenir des colonies bien isolées. Incuber les boîtes en atmosphère microaérophile à 41,5 °C
...
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